_.jpg)
DNA kloning
metode terapi gen adalah rekayasa genetika, untuk penyakit genetik permanen pada tingkat kromosom atau gen dengan pemberian suatu fragmen DNA. Fokus terapi gen pada penyakit yang dipicu kerusakan satu gen, tehnik biologi molekuler untuk melacak urutan DNA dari mikroorganisme tertentu , ini memungkinkan untuk dipakai sebagai sarana diagnosa, Tehnik itu dinamakan Polymerase Chain Reaction (PCR), yang sudah pernah dipakai untuk skrining penderita infeksi ,Biologi molekuler bisa dikembangkan sebagai alat untuk diagnosa bermacam macam metode bisa dimanfaatkan untuk dunia kedokteran antara lain kloning, terapi gen, PCR, SSCP, RFLP,
memakai molekul untuk pemanfaatan bermacam macam metode biologi molekuler dalam analisa penyakit , gen , analisa penyakit bawaan , fungsi gen
dengan adanya perkembangan DNA rekombinan dan metode kloning , Dasar DNA
rekombinan mengacu pada mencampur ulang fragmen DNA yang berbeda beda , kloning mengacu pada proses penyusunan ulang beberapa salinan molekul DNA, Mekanisme untuk menghasilkan molekul rekombinan dengan melibatkan cara cara penyisipan fragmen fragmen DNA, eksogen (circular double stranded DNA) berasal vektor plasmid atau bakteriofag (virus yang menginfeksi bakteri) berbasis vektor ,
Vektor mengacu pada molekul DNA yang dipakai untuk membawa atau mengangkut DNA yang diinginkan ke dalam sel ,
TEKNOLOGI MOLEKULER DNA
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk memperkuat DNA jutaan kali lipat, dalam waktu singkat dengan replikasi berulang template, dengan
memakai set tertentu dalam vitro oligonukleotida sintesis untuk sintesis DNA
prima, Desain tergantung pada urutan DNA yang diinginkan untuk dianalisa, metode ini dilakukan melalui 50 siklus ,pencairan template pada
suhu tinggi, yang memungkinkan primer untuk urutan gratis dalam template
dan lalu mereplikasi template dengan DNA polimerase. Proses ini sudah otomatis dengan memakai DNA polimerase termostabil diisolasi dari bakteri yang tumbuh di ventilasi termal di laut atau air panas, Selama putaran pertama replikasi satu salinan DNA diterjemahkan menjadi dua salinan dan seterusnya memicu peningkatan eksponensial jumlah salinan dari urutan yang ditargetkan oleh primer. Sesudah hanya 20 siklus satu salinan DNA diperkuat lebih dari 2.000.000 kali lipat. hasil dari reaksi PCR dianalisa dengan pemisahan dalam gel agarosa
diikuti oleh bromida pewarnaan dan visualisasi dengan transillumination ultraviolet Atau, dNTP radioaktif bisa ditambahkan untuk PCR dalam rangka untuk
menyatukan label ke dalam hasil , hasil dari PCR yang divisualisasikan oleh paparan gel untuk film x-ray. Keuntungan memakai radiolabeling pada hasil PCR adalah bisa meningkatkan kuantitas tingkat hasil amplifikasi , Jumlah salinan DNA yang dihasilkan melalui proses PCRReaksi berantai polimerase bisa dipakai untuk memperkuat baik ganda dan beruntai tunggal (contohnya hasil dari reaksi transkripsi terbalik, RT-PCR) DNA.
Template dicampur dengan primer khusus atau merosot, dNTP, buffer polimerase
termasuk DNA polimerase MgCl2 dan termostabil. Template adalah didenaturasi pada suhu tinggi ( 95 ° C) dan lalu didinginkan ke suhu rendah ,
memungkinkan primer mengikat. Suhu reaksi lalu dinaikkan ,
untuk DNA polimerase ( 72 ° C) dimana primer diperluas sepanjang
template. Rangkaian langkah ini dilakukan 20 sampai 30 kali mengarah ke amplifikasi eksponensial dari template target. Amplifikasi ini besar , hasil reaksi
bisa divisualisasikan berikut elektroforesis gel ,
PCR bisa dipakai dalam analisa gen penyakit dengan memperkuat jumlah terdeteksi fragmen khusus DNA. Amplifikasi fragmen dari gen penyakit
mungkin lebih besar, karena insersi, atau lebih kecil, karena penghapusan, amplifikasi DNA dengan PCR memungkinkan analisa gen penyakit dalam contoh bahan sangat kecil . contohnya, hanya sedikit sel janin perlu diekstraksi dari cairan ketuban untuk menganalisa keberadaan gen penyakit tertentu, mutasi titik tunggal bisa dideteksi dengan metode PCR direkayasa seperti reaksi berantai ligase (LCR) dan polimorfisme konformasi PCR-tunggal-untai (PCR-SSCP) analisa. metode PCR juga bisa dipakai untuk mengetahui tingkat ekspresi gen dalam contoh bahan yang sangat kecil , contohnya jaringan atau sel-sel dari tubuh. metode ini dinamakan reverse transcription-PCR (RT-PCR) ,
Contoh kelainan genetik yang bisa terdeteksi oleh PCR
disease : β-Thalassemia
affected gene
: mutations in β-globin gene that result in loss of
synthesis of protein
disease : Hemophilia A
affected gene
: Factor VIII
disease : Hemophilia B
affected gene
: Factor IX
disease : von Willebrand disease
affected gene
: von Willebrand factor (vWF)
disease : Severe-combined
immunodeficiency, SCID
affected gene
: adenosine deaminase (ADA)
disease : Lesch-Nyhan syndrome
affected gene
: hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
(HGPRT)
disease : α1-Antitrypsin deficiency
affected gene
: α1-Antitrypsin
disease : Cystic fibrosis
affected gene
: cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR)
protein
disease : Fabry disease
affected gene
: α-galactosidase
disease : Gaucher disease
affected gene
: acid β-glucosidase (glucocerebrosidase)
disease : Sandhoff disease
affected gene
: hexosaminidase A and B
disease : Tay-Sachs disease
affected gene
: hexosaminidase A
disease : Familial hypercholesterolemia
(FH)
affected gene
: LDL receptor
disease : Glucose-6-phosphate
dehydrogenase deficiency
affected gene
: glucose-6-phosphate dehydrogenase
disease : Maple syrup urine disease
affected gene
: branched-chain α-keto acid dehydrogenase
disease : Phenylketonuria (PKU)
affected gene
: phenylalanine hydroxylase
disease : Ornithine transcarbamylase
deficiency
affected gene
: ornithine transcarbamylase
disease : Retinoblastoma (Rb)
affected gene
: RB gene product, pRB
disease : Sickle-cell anemia
affected gene
: point mutation in β-globin
PCR-dimediasi jenis cDNA tertentu dalam reaksi RT. cDNA yang dihasilkan selama
reaksi RT adalah representasi ke pola gen yang sedang diekspresikan pada saat
ekstraksi RNA.
Total RNA seluler bisa diekstraksi dari jaringan atau sel melalui bermacam macam
metode dan dipakai sebagai template untuk RT, isolasi RNA pertamakali memakai primer acak. Sebuah alikuot kecil reaksi RT ini lalu ditambahkan ke reaksi PCR mengandung primer khusus untuk melakukan amplifikasi, hasil-hasil dari RT-PCR bisa lalu divisualisasikan seperti dijelaskan di atas untuk PCR standar ,
Banyak kelainan bawaan akibat perubahan nukleotida tunggal pada area
kritis dari gen yang terpapar (contohnya anemia sel sabit). metode PCR-SSCP bisa
mendeteksi mutasi gen tunggal karena mobilitas konformasi diubah dari untaian
tunggal DNA (dalam gel elektroforesis) membawa mutasi relatif terhadap untaian wild type yang normal. Primer PCR khusus dibuat sesuai urutan gen suatu penyakit untuk mengetahui mutasi dengan cara amplifikasi DNA melalui PCR. Amplifikasi yang sama pada gen wild type. Kedua untai hasil PCR wild type akan bermigrasi berbeda dibandingkan dengan 2 untai hasil PCR mutan. Bahkan mutasi titik tunggal memicu untai DNA amplifikasi yang ada di konformasi
berbeda yang mengubah mobilitas mereka saat di jalankan pada gel
elektroforesis non-denaturing, Cara memvisualisasikan hasil PCR pada gel elektroforesis adalah dengan melakukan nukleotida radioaktif atau label radioaktif yang dimasukkan ke dalam hasil PCR. hasil PCR dipisahkan dalam gel poliakrilamid dan divisualisasikan pada film x-ray. pasien yang homozigot wild type pada lokus yang dianalisa akan memperlihatkan dua band yang berbeda pada gel seperti homozigot mutan. Namun, karena perubahan nukleotida hasil PCR mutan akan bermigrasi dengan mobilitas yang berbeda dalam gel, pasien yang heterozigot akan memperlihatkan pola yang terdiri dari semua 4 band,
PCR-SSCP analisa gen sabit β-globin dan sel normal , Mutasi A ke T diperlihatkan dengan warna biru. mutasi PCR diperkuat dan hasil dipisahkan pada gel poliakrilamid non-denaturing. hasil PCR dari lokus jenis wild type dan lokus sel sabit akan bermigrasi berbeda disebabkan konformasi urutan-khusus. Normal akan menampilkan dua band sebagai akan homozigot sel sabit pasien (meskipun dengan ukuran yang berbeda dari normal) homozigot. pasien heterozigot
pada lokus sel sabit akan menampilkan 4 band,
Reaksi Rantai ligase adalah metode yang memungkinkan deteksi mutasi
titik tunggal pada gen penyakit. metode ini memanfaatkan DNA ligase termostabil
untuk menyambung oligonukleotida (oligos) yang berdekatan secara sempurna. 2
set oligos dirancang untuk annealing ke salah satu untai gen di lokasi mutasi, set kedua dari dua anneals oligos ke untai lainnya. Para oligos dirancang sedemikian rupa sehingga mereka hanya akan benar-benar anil ke urutan wild type. Contoh yang diperlihatkan di bawah ini untuk mutasi sel sabit, nukleotida 3 'satu oligo di masing masing pasangan sesuai , Ketidaksesuaian ini mencegah anil dari oligos berbatasan langsung dengan satu sama lain, oleh sebab itu ligase DNA tidak akan meligase dua oligos masing-masing pasangan bersama-sama.
Dengan urutan wild type oligo pasangan yang sedang diligasi menjadi target bersama untuk anil di oligos dan, karenanya, memicu amplifikasi eksponensial dari
target wild type. bahwa pengetahuan urutan sebelumnya diperlukan untuk
mendeteksi mutasi titik pada gen penyakit, metode LCR dipakai untuk diagnosa
adanya alel mutan pada pasien risiko tinggi .kloning
Setiap fragmen DNA bisa digandakan sesudah dimasukkan ke dalam vektor
yang sesuai untuk transformasi bakteri sel host. kloning mengacu pada hasil
jumlah besar molekul DNA identik dan biasanya melibatkan pemakaian sel bakteri
sebagai sel host untuk DNA, walaupun kloning bisa dilakukan dalam sel eukariotik
juga. kloning cDNA mengacu pada hasil suatu perpustakaan DNA kloning yang mewakili semua mRNA dalam sel atau jaringan tertentu , kloning genom mengacu pada hasil suatu perpustakaan DNA kloning mewakili seluruh genom suatu organisme tertentu. Dari salah satu dari jenis DNA library bisa berasal dari isolat (dengan bermacam macam protokol skrining) suatu.cDNA clone tunggal atau gen.
Dalam rangka untuk mengkloning baik cDNA atau salinan gen vektor diperlukan
untuk membawa DNA kloning. Vektor yang dipakai dalam biologi molekul dari dua kelas dasar. Satu kelas vektor berasal dari plasmid bakteri, plasmid adalah DNA circuler ditemukan pada bakteri yang bereplikasi secara autosomal dari genom inang. DNA ini pertama kali diketahui karena plasmid membawa gen resistensi antibiotik. Gen-gen resistensi antibiotik ditemukan pada plasmid dipakai dalam modern plasmid vitro direkayasa untuk pemilihan bakteri yang sudah diambil plasmid yang berisi DNA , Plasmid terbatas di dalam bentuk fragmen pasangan DNA kurang dari 10.000 (pb) bisa digandakan, Dalam fragmen praktek sekitar 5.000 bp adalah batas ,
Jenis lain dari vektor berasal dari bakteriofag (virus bakteri) lambda. Virus ini mampu baik lysogeny (integrasi ke dalam genom inang) dan lisis (infeksi diikuti oleh lisis dari hostyang terinfeksi). Gen yang diperlukan untuk lysogeny sudah dihapus dari vektor lambda yang berbasis memungkinkan hanya siklus hidup litik untuk mengambil tempat.Keuntungan untuk vektor lambda berbasis adalah bahwa mereka bisa membawa fragmen DNA hingga 25.000 bp. Dalam analisa genom pasien bahkan vektor lambda berbasis membatasi dan kromosom ragi buatan (YAC) sistem vektor sudah dikembangkan untuk
kloning DNA fragmen sampai dengan 500.000 bp ,
Complimantary DNA (cDNA) dibuat dari mRNA dari sebuah sel oleh beberapa metode yang terkait. Masing-masing metode terdiri dari transkripsi balik pertama dari mRNA diikuti oleh sintesis dari kedua untai DNA dan penyisipan dari cDNA-double stranded menjadi baik vektor plasmid atau lambda untuk kloning , Proses ini menciptakan sebuah perpustakaan cDNA clone yang mewakili masing-masing spesies mRNA. Skrining klon cDNA bisa dilakukan dengan memakai asam nukleat atau probe protein-based (protein atau antibodi). Skrining cDNA juga dapt dilakukan melalui assay biologis dari hasil yang dihasilkan oleh cDNA kloning ,
Proses untuk hasil dan kloning cDNA. Contoh ini memperlihatkan pemakaian adaptor-primer khusus berisi urutan untuk enzim restriksi NotI di samping (T) poli untuk anil ke ekor (A) poli RNA. dimungkinkan hanya memakai poli (T), atau poli (T) dengan situs pembatasan lain atau primer acak (campuran oligos yang mengandung urutan acak) untuk memulai reaksi untai pertama cDNA. Dalam beberapa kasus poli (T) priming tidak memungkinkan untuk perpanjangan cDNA ke ujung 5'-dari RNA, pemakaian primer acak bisa mengatasi masalah ini karena untai sintesis pertama sepanjang mRNA. metode ini memperlihatkan ligasi adapter EcoRI diikuti oleh EcoRI dan pencernaan NotI. Proses ini
memungkinkan cDNA untuk digandakan dalam satu arah, dinamakan kloning terarah. Skrining dengan berlabel dengan nukleotida diubah yang dikenali oleh antibodi khusus dan dideteksi oleh tes kolorimetri atau chemiluminescent. Probe asam nukleat bisa dihasilkan dari DNA (termasuk oligonukleotida sintetik, oligos) atau RNA. Probe asam nukleat bisa diberi label radioaktif atau protein, antibodi atau dengan uji biologis adalah mekanisme untuk analisa ekspresi protein dari cDNA kloning dan diberi istilah ekspresi kloning ,
Mayoritas kloning genom memakai sistem berbasis vektor lambda. Sistem
ini vektor mampu membawa 15-25,000 bp DNA. kloning fragmen sedikit lebih besar dari DNA genom bisa dilakukan memakai sistem plasmid-lambda vektor
chimeric dinamakan sebuah kosmid. vektor Kosmid hanya berisi cos (kohesif) ujung genom lambda (diperlukan untuk kemasan DNA menjadi partikel virus yang menular) bersama dengan gen resistensi antibiotik plasmid dan asal replikasi DNA. Sejak sekitar 30.000 pb DNA lambda sudah dihapus dari vektor kosmid, lebih besar fragmen DNA genom bisa digandakan. Fragmen DNA genom yang berukuran lebih besar bisa dikloning ke vektor YAC ,
Genomik DNA bisa diisolasi dari sel atau jaringan untuk kloning. DNA
genom pertama kali dilisis oleh enzim restriksi menghasilkan fragmen dengan ukuran yang optimal untuk vektor yng akan dipakai untuk kloning. bahwa
beberapa pasang basa gen lebih panjang dibandingkan yang bisa dimasukkan ke
konvensional atau vektor lambda kosmid, kloning yang di insersikan dari genomic library harus over lapping , Untuk menghasilkan kloning
tumpang tindih, DNA hanya sebagian dilisis oleh enzim restriksi. Ini berarti bahwa
tidak setiap situs restriksi, hadir dalam semua salinan gen dalam
penyusun urutan DNA yang bereplikasi. DNA sebagian dilisis lalu ukuran ditentukan oleh bermacam macam metode (contohnya elektroforesis gel atau sentrifugasi gradien)
sebelum kloning. Skrining genom library dilakukan dengan probe berbasis asam
nukleat. Namun, mereka bisa disaring dengan protethat diketahui urutan pita DNA
khusus (contohnya faktor transkripsi) ,
Protokol DNA genomik khusus kloning digambarkan di bawah ini. Diagram
representasi dari gen hipotetis dalam penyiapan DNA genom. Kotak memperlihatkan ekson dan garis memisahkan kotak mewakili intron. Panah tebal memperlihatkan posisi situs enzim restriksi, contohnya Sau3AI. Sesudah enzim merestriksi parsial bermacam macam fragmen gen yang akan dihasilkan, 4 fragmen yang mungkin diperlihatkan. Fragmen di ukuran 15-25 pasang kilobase (kbp) yang dimurnikan dengan elektroforesis gel atau sentrifugasi gradien dan diligasikan ke dalam vektor lambda. DNA itu dikemas ke dalam partikel fag in vitro dan dipakai untuk menginfeksi E. Coli
YAC vektor memungkinkan kloning, dalam sel-sel ragi, fragmen DNA genom
yang memiliki panjang sekitar 500.000 pb. Vektor ini berisi beberapa elemen
kromosom ragi khas, maka YAC panjang. Vektor YAC mengandung sentromer ragi
(CEN), telomeres ragi (TEL), telomer adalah urutan tertentu yang hadir pada ujung
kromosom dan yang diperlukan untuk replikasi) dan ragi mandiri mereplikasi urutan
(ARS) ARSes Ragi pada dasarnya asal-usul yang berfungsi dalam replikasi sel-sel ragi mandiri dari replikasi asal replikasi kromosom ragi. vektor YAC juga mengandung gen, (URA3 contohnya, sebuah gen yang terlibat dalam sintesis urasil) yang memungkinkan pemilihan sel ragi yang sudah diambil vektor, Dalam rangka untuk menyebarkan vektor dalam sel bakteri, sebelum penyisipan DNA genom, vektor YAC mengandung asal replikasi bakteri dan penanda
dipilih bakteri seperti fro gen resistensi ampisilin ,
Dalam kloning DNA genomik dalam vektor YAC khas, DNA genom sebagian
dicerna dengan EcoRI dan fragmen rata rata 400-500 pasang kilobase (kbp) yang
dimurnikan dengan gel elektroforesis lapangan berdenyut, PFGE. Vektor YAC dicerna dengan EcoRI dan BamHI yang menempatkan urutan telomer pada ujung vektor linierisasi. Fragmen BamHI kecil dipisahkan dari sisa vektor YAC dengan
elektroforesis gel standar. DNA genomik lalu diligasi ke vektor dan lalu dipakai untuk mentransformasi sel-sel ragi ,
Representasi diagram dari vektor YAC biasa dipakai untuk mengkloning DNA genom. Vektor berisi telomeres ragi (TEL), sebuah sentromer (CEN), penanda dipilih (URA3), dan mandiri urutan mereplikasi (ARS) dan urutan plasmid bakteri untuk seleksi antibiotik dan replikasi dalam E. coli.
analisa cDNA kloning dan gen melibatkan beberapa metode, Karakterisasi
awal biasanya melibatkan pemetaan jumlah dan lokasi situs enzim restriksi berbeda. Informasi ini bermanfaat untuk sequencing DNA karena menyediakan sarana untuk merestriki kloning menjadi fragmen khusus untuk sub-kloning, sebuah proses yang melibatkan kloning fragmen dari DNA kloning tertentu. Sesudah DNA sepenuhnya ditandai kloning cDNA bisa dipakai untuk menghasilkan RNA in vitro dan RNA diterjemahkan secara in vitro untuk karakterisasi protein. kloning cDNA juga bisa dipakai sebagai probe untuk menganalisa struktur gen dengan Southern blotting atau menganalisa ukuran RNA dan pola ekspresi oleh Northern blotting. Northern blotting juga adalah alat yang bermanfaat dalam analisa organisasi ekson-intron klon gen karena hanya fragmen gen yang mengandung ekson akan mengawinkan silang ke
RNA pada noda itu ,
Southern Blotting: Southern blotting adalah analisa struktur DNA
ditempelkan pada fase berikut lampiran solid. Tahap pertama adalah merestriksi DNA dengan enzim restriksi maka fragmen DNA yang dihasilkan dipisahkan dalam gel agarosa. Gel diperlakukan dengan NaOH untuk mengubah sifat sesuatu benda DNA, maka NaOH ini dinetralkan. DNA dikirim dari gel ke nitroselulosa atau nilon kertas filter dengan baik difusi kapiler atau di bawah arus listrik , DNA ini
tetap filter dengan baking atau terapi sinar ultraviolet. Filter lalu bisa
dideteksi untuk kehadiran fragmen DNA yang diberikan dengan cara radioaktif atau bukan -bermacam macam radioaktif.Northern Blotting : Northern blotting melibatkan analisa RNA dengan melakukan penempelan pada fase solid. RNA ini berukuran oleh gel elektroforesi lalu dikirim ke nitroselulose atau nilon kertas filter untuk Southern blotting.
Probing filter untuk RNA tertentu dilakukan mirip dengan probe Southern blot ,
Western Blotting: Western blotting melibatkan analisa protein yang
dilekatkan pada fase solid. Protein dipisahkan dengan ukuran-PAGE elektroforesis
SDS dan dikirim ke nitroselulose atau filter nilon. Filter ini lalu diperiksa
dengan antibodi yang diajukan terhadap protein tertentu.
Variabilitas genetik pada lokus tertentu (gen) perubahan dasar akibat kecil
bahkan bisa mengubah pola fragmen restriksi enzim pencernaan yang bisa
dihasilkan. perubahan patogen untuk genotipik bisa karena penghapusan atau sisipan di dalam gen yang dianalisa atau bahkan substitusi nukleotida tunggal yang bisa membuat atau menghapus situs enzim restriksi pengakuan ,
analisa RFLP mengambil keuntungan dari ini dan memanfaatkan Southern
blotting direstriksi oleh endonuclease DNA genom untuk mendeteksi pola keluarga dari fragmen gen yang diberikan, terdeteksi dengan penapisan Southern blotting dengan probe sesuai dengan gen yang diinginkan. Sebuah contoh klasik dari penyakit yang terdeteksi oleh RFLP adalah anemia sel sabit ,Hasil sabit anemia sel (pada tingkat gen) dari perubahan nukleotida tunggal (A
T) pada kodon 6 dalam gen β-globin. Perubahan ini menyebabkan glutathione (G)
untuk val (V) substitusi asam amino, sementara pada saat yang sama menghapuskan pembatasan situs MstII. Akibatnya probe gen β-globin bisa dipakai untuk mendeteksi MstII fragmen restriksi. bahwa ada dua salinan dari setiap gen di semua sel pasien. RFLP mendeteksi kedua salinan: yang Alel terpengaruh dan alel terpengaruh. Ukuran variabilitas dalam fragmen terdeteksi dalam silsilah keluarga memperlihatkan perbedaan dalam pola situs restriksi dalam dan di sekitar gen yang sedang dianalisa, Pola RFLP yang diwariskan dan memisahkan dalam mode Mendel sehingga memungkinkan pemakaiannya dalam genotip seperti dalam kasus nvestigasi kriminal.
Bentuk lain dari polimorfisme DNA terdeteksi oleh hasil pemetaan klasik
RFLP dari variasi diwariskan dalam jumlah elemen DNA tandem urutan yang
berulang 2-60 bp panjang. Jumlah mengulangi juga variabel 2-40 eksemplar. Elemen ini dinamakan berulang tandem variabel nomor (VNTR). saat pencernaan enzim restriksi memotong DNA mengapit VNTRs, panjang fragmen yang dihasilkan akan bervariasi tergantung pada jumlah mengulang pada lokus tertentu. Banyak lokus VNTR berbeda sudah diketahui dan sangat bermanfaat untuk analisa sidik jari DNA seperti dalam kasus identitas forensik dan ayah.
Respresentation diagram dari analisa RFLP untuk kehadiran lokus sel sabit. Genomik DNA diisolasi dan dicerna dengan enzim restriksi MstII. Satu MstII situs hilang di lokus sel sabit. DNA ini lalu dihapuskan dan dianalisa dengan probe β-globin-khusus sesuai dengan urutan pada akhir 5'-gen. pasien homozigot untuk gen globin normal akan memperlihatkan sebuah band hibridisasi tunggal karena kedua gen ibu dan ayah tidak akan terpengaruh. Heterozigot akan
memperlihatkan band band normal dan sel sabit gen yang lebih besar. Homozigot sel sabit pasien akan memperlihatkan sebuah band hibridisasi tunggal yang lebih besar.
metode konvensional untuk sequencing dengan metode sekuensing Maxam dan Gilbert, bergantung pada replikasi nukleotida atau DNA dan tidak secara rutin dipakai lagi. metode enzimatik, Sanger sequencing, melibatkan pemakaian dideoxynucleotides (2 ', 3'-dideoksi) yang mengakhiri sintesis DNA dan karena itu dinamakan sekuensing terminasi rantai dideoksi
Protokol Sanger sekuensing DNA memakai dideoxynucleotides (ddNTPs) untuk
menghentikan perpanjangan rantai DNA dari template kloning selama sintesis in vitro. Sintesis diawali dengan memakai primer oligonukleotida tertentu. Selama reaksi sintesis nukleotida radioaktif (biasanya dATP) dimasukkan ke dalam untaian elongating. Empat reaksi terpisah dilakukan secara bersamaan, masing-masing berisi semua 4 dNTP dan ddNTP tunggal. Semakin tinggi konsentrasi ddNTP perpanjangan lebih sering rantai akan ditutup sehingga bisa mengatur
tingkat informasi urutan diperoleh dengan memvariasikan dNTP / rasio ddNTP. Menyusul reaksi ekstensi hasil yang diselesaikan dengan elektroforesis pada gel (urea) denaturing poliakrilamida. Hasil yang diperoleh saat gel dikeringkan dan terpapar film x-ray. Pita (band) dekat bagian bawah gel adalah hasil reaksi pendek (yaitu yang paling dekat dengan ujung 3'-primer) dan pita (band) pling atas adalah hasil yang terpanjang.
analisa Microarray melibatkan pemakaian apa yang biasanya dinamakan
"chips gen" untuk menentukan ekspresi set besar gen pada saat yang sama dalam
percobaan tunggal. Gene chip bisa dibeli dari beberapa perusahaan yang berbeda,
contohnya Affymetrix, atau mereka bisa kustom dipersiapkan di laboratorium dengan peralatan yang sesuai. Chip gen Affymetrix diciptakan melalui lampiran kovalen oligonukleotida sintetik (oligos) ke permukaan kecil ,ada 20 atau lebih oligos berbeda pada chip yang sesuai dengan daerah yang berbeda tiap gen yang akan dianalisa, satu set oligos yang masing-masing berisi ketidaksesuaian nukleotida ditambahkan sebagai kontrol negatif untuk setiap gen. Teknologi menciptakan chip gen sehingga bisa ada 10's ribu gen yang berbeda diwakili pada satu chip kira-kira 2 cm persegi,
Meskipun ada banyak dipakai untuk chip gen, percobaan yang melibatkan perbandingan ekspresi gen pada chip antara dua contoh bahan, contohnya sel
kanker dan sel normal. Pengujian dilakukan dengan menyusun RNA dari contoh bahan masing-masing dan mengubah RNA cDNA di hadapan nukleotida neon. contohnya, satu RNA contoh bahan diubah menjadi cDNA dengan nukleotida neon hijau dan contoh bahan RNA lainnya diubah menjadi cDNA di hadapan sebuah nukleotida neon merah. Ini "tag" olahan cDNA dinamakan "target" dan jumlah yang sama dari masing-masing sasaran.persiapan dicampur bersama dan lalu hibridisasi untuk chip gen. Sesudah pencucian dari target unhybridized dan pengolahan gambar dari satu chip akan melihat bintik-bintik yang hanya hijau, hanya merah, atau warna di antara yang adalah campuran dari beberapa merah dan hijau,, beberapa tempat akan menjadi kuning, Bintik-bintik merah yang hanya
memperlihatkan bahwa gen itu terungkap hanya di sumber target berlabel merah dan sebaliknya untuk bintik hijau. Intermediate warna memperlihatkan perbedaan tingkat ekspresi gen pada kedua contoh bahan. memakai komputer untuk menentukan satu hibridisasi intensitas akan memperoleh gambaran yang lengkap dari tingkat ekspresi dari masing-masing gen pada chip di setiap persiapan RNA.
Transgenesis mengacu pada proses mengenalkan gen eksogen ke dalam
garis kuman organisme. Transgenesis percobaan pertama yang berhasil dilakukan pada tikus. Satu percobaan relatif dikenal terlibat pengenalan gen hormon pertumbuhan tikus ke dalam garis kuman mencit. Tikus transgenik ini tumbuh dua kali ukuran normal mereka.
Untuk membuat binatang transgenik gen harus diwariskan dari generasi ke generasi, yaitu harus diwariskan pada keturunan bakteri. Untuk mencapai
ini dengan tikus atau hewan ternak, vektor yang mengandung gen
dengan unsur-unsur yang sesuai (contohnya promotor β-lactoglobulin jika
ekspresi transgen dalam susu yang diinginkan) yang disuntikkan ke dalam inti telur dibuahi. Telur-telur itu lalu dipindahkan ke dalam rahim perempuan
menerima untuk pengembangan keturunan transgenik potensial. Dalam rangka untuk menguji hewan yang dihasilkan untuk saluran transmisi bakteri dari transgen DNA kromosom keturunan mereka diuji untuk kehadiran transgen ,
Saat ini proses transgenesis sedang dipakai baik di industri tanaman dan
ternak. Tujuan dari sebagian besar percobaan ini adalah untuk menghasilkan tanaman dan hewan yang lebih tahan terhadap penyakit dan infeksi , Namun, beberapa hewan pertanian transgenik seperti domba dan sapi
sedang dikembangkan dalam rangka untuk memperoleh tingkat tinggi ekspresi protein terapi penting selama sintesis susu , ini memungkinkan beberapa
besar protein dari bunga yang akan dimurnikan dari susu hewan transgenik.
Pada biasanya terapi penyakit dilakukan berdasar timbulnya gejala
tidak terkecuali untuk penyakit genetik seperti kanker. sudah diketahui bahwa suatu penyakit terjadi akibat ekpresi gen yang menghasilkan protein tidak normal. Dengan adanya projek genetik pasien (Human Genetic Project) maka sudah berhasil diketahui seluruh gen yang berada pada 22 pasang kromosom autosomal dan..sepasang kromosom sex ,
Terapi gen atau gene therapy adalah salah satu metode terapi
penyakit genetik permanen dengan pemberian suatu fragmen Deoxyribo nuclease acid (DNA). Prinsip dasar terapi gen adalah rekayasa genetika, proses ini dilakukan dengan cara menggabungkan gen normal dengan vector DNA sebagai vehicle lalu diinsersikan pada kromosom yang memiliki gen tidak normal. Terapi gen ditujukan untuk memperbaiki kesalahan metabolisme pada penyakit kelainan genetic, kanker, penyakit.infeksi, atau kelainan autoimun ,
Mengapa terapi gen bisa dilakukan antara lain : DNA diketahui sebagai
materi pembawa informasi genetik, struktur DNA dan kode genetic sudah bisa
diketahui, selain itu ditemukan pemotong DNA yaitu enzim endonuklease, metode
rekombinan gen (recombinant DNA) sudah bisa dilakukan dan hasil campur ulang
DNA bisa dihasil pada sel bakteri. Alasan lainnya adalah adanya proses
cloning dan penggandaan DNA, maping DNA pasien sudah diketahui sehingga
proses terapi gen sudah dimulai sejak tahun 1990.
Dua macam cara melakukan terapi gen yaitu gen terapi pada sel somatik dan
terapi pada sel rehasil. Terapi sel somatic (somatic cell) lebih mudah dilakukan
dan secara etika bisa diterima namun koreksi hanya terjadi pada satu generasi yaitu
hanya pada pasien yang mengalami terapi tidak untuk keturunannya. Terapi sel
rehasil (Germ-line therapy) secara metode sulit dilakukan dan secara etika sulit
diterima. Terapi gen pada sel rehasil bisa memperbaiki atau memperbaiki gen
pada semua generasi baik pasien maupun keturunannya , Dari beberapa analisa yang sudah dilakukan terapi sel rehasilsi hanya dilakukan pada hewan.
Prinsip dasar terapi gen adalah : gene addition dilakukan dengan cara
menambahkan gen normal namun gen rusak tetap ada, biasanya dilakukan untuk
pendekatan penyakit resesif ; gene replacement dilakukan dengan cara mengganti gen yang rusak ditujukan untuk penyakit dominan; sedang gene substraction dilakukan untuk mencegah ekspresi gen, dengan cara terapi anti-sens atau terapi antigen ,
Proses terapi gen dilakukan melalui identifikasi gen normal dan tidak normal,
menghasilkan DNA rekombinan, memilih metode kirim gen normal (ex vivo atau in
vivo), dan memastikan regulasi ekspresi dari gen yang sudah dikirim ,
Metode kirim gen normal kedalam sel pasien bisa dilakukan diluar tubuh
(ex vivo), metode ini dilakukan pada sel atau jaringan yang bisa dikeluarkan dan
dikembalikan ke tubuh pasien contohnya komponen system hemopoitik, kulit, dan sel
endothelial. kirim gen yang dilakukan langsung ke dalam sel atau jaringan pada
pasien dikenal dengan metode in vivo , Proses in vivo dilakukan
melalui cara ,antaralain :
-Memasukkan secara injeksi DNA yang sudah dikonjugasikan dengan
karier ke dalam DNA target. contohnya antibody dikonyugasikan dengan
asialoglycoprotein lalu dimasukkan ke dalam DNA target di organ hati.
-Memasukkan partikel bombardement yaitu DNA yang dilapisi komponen
metal lalu ditembakkan ke dalam sel ( otot, sel,limpa,hati, kulit, pankreas )
-Memasukkan DNA secara langsung memakai jarum suntik ke dalam
jaringan khusus; contohnya gen dystrophin disuntikkan langsung ke dalam sel otot atau melalui infus masuk ke pembuluh darah,
-Memasukkan secara injeksi DNA yang sudah dilapisi lipid sehingga
bisa berikatan dengan sel atau di endositosis oleh sel,
penghantaran gen ke dalam sel pasien dilakukan melalui jasa virus. Virus bisa berfungsi sebagai vehicle yang menghantarkan DNA mencapai target sel yang diinginkan . bermacam macam virus yang bisa.dimanfaatkan untuk membantu proses terapi gen, antara lain :
- Virus Moloney murine leukemia (MoMLV) dimanfaatkan pada keganasan (malignant oncogen)
- Virus Herpes simplex virus (HSV) dipakai untuk mencapai target central
nervous system (CNS) pada Latent infections in neurons
- Virus Retro, adalah virus bergenom RNA dimanfaatkan untuk membawa DNA
mencapai sel T pada severe combined immunodeficiency (SCID) atau
mencapai sel hepatosit pada familial hypercholesterolemia.
- Virus Adeno adalah virus bergenom DNA dipakai untuk membawa DNA mencapai target sel epithelium nasal/bronkus atau kornea pada cystic fibrosis.
pengawasan ketat terapi gen dilakukan dengan cara ,antaralain:
-Identifikasi mRNA dengan metode Reverse Trancriptase - Polyerase chain
reaction (RT-PCR) untuk mengetahui proses transkripsi gen.
- Imunoassay untuk mengetahui protein hasil translasi.
- Identifikasi gen dengan metode Polyerase chain reaction (PCR) untuk
mendeteksi keberadaan cDNA yang dimasukkan.
Uji-uji lain yang berkaitan dengan efek fisiologi sebagai akibat dari
penyakit genetikTerapi gen pertama dilakukan tahun 1999 dilakukan pada pasien pasien anak perempuan berusia 6 tahun yang mengalami SCID akibat defisiensi ADA. Penderita ini memiliki risiko tinggi terhadap infeksi oportunis dan malignancy. Gen ada adalah gen housekeeping yang regulasi tidak ketat dan sudah berhasil di cloning pada tahun 1983 ,
Melalui vektor retrovirus dilakukan gene replacement pada sel T normal.
Limfosit pasien anak itu dikultur secara in vitro lalu dimasukkan kedalam
tubuhnya dengan cara infus sel T yang gen ada nya sudah diperbaiki ,
Terapi gen diulang setiap 1-2 bulan pada tahun pertama terapi dan setiap 3 – 6
bulan pada tahun kedua. Sesudah tahun kedua pasien anak ini diperbolehkan rawat jalan dengan bermacam macam pengawasan ketat terhadap pembentukan antibodi , respons terhadap imunisasi , dan penurunan kejadian infeksi . Hasil terapi gen pada pasien anak itu adalah bebas sinusitis dan nyeri kepala dan dua tahun sesudah terapi tamat sekolah
.Transgenesis dengan pasien memungkinkan untuk penghapusan gen
penyakit dalam populasi keturunan, Namun, teknis maupun isu-isu etis kemungkinan akan mencegah percobaan transgenik dilakukan dengan telur pasien , kemampuan untuk menggantikan gen penyakit yang dikenal
dengan salinan yang normal pada pasien menderita adalah tujuan akhir dari terapi
gen. protokol terapi gen pasien bertujuan untuk mengenalkan mengoreksi
salinan gen penyakit ke dalam sel somatik dari pasien yang terpapar , Ekspresi dari salinan DNA yang benar dari gen terpengaruh dalam sel-sel
somatik mencegah penularan melalui garis kuman, dengan demikian, menghindari
banyak masalah etis dari transgenesis. ini analog dengan perlakuan terhadap
pasien dengan transplantasi organ atau jaringan ,
metode yang paling biasa dipakai dalam analisa terapi gen adalah pengenalan
gen diperbaiki menjadi sel-sel sumsum tulang, fibroblas kulit atau hepatosit. Vektor yang paling biasa dipakai berasal dari retrovirus dan hanya memanfaatkan daerah promotor transkripsional virus ini (yang LTRs) untuk mendorong ekspresi gen yangdiinginkan. Keuntungan dari sistem vektor retrovirus berbasis ekspresi yang terjadi.pada tipe sel paling ,
beberapa kelainan bawaan pasien sudah diperbaiki pada sel kultur dan
beberapa penyakit (contohnya SCID,melanoma maligna dan penyakit imunodefisiensi gabungan yang berat)
Gangguan pasien Ditangani di Sel budidaya oleh Gene Terapi
Disorder:Phenylketonuria (PKU)
Affected Gene:phenylalanine hydroxylase
Disorder:β-Thalassemia
Affected Gene:β-Globin
Disorder:Hemophilia B
Affected Gene:Factor IX
Disorder:SCID
Affected Gene: adenosine deaminase (ADA)
Disorder:SCID
Affected Gene:purine nucleoside phosphorylase (PNP)
Disorder:Lesch-Nyhan syndrome
Affected Gene:hypoxanthine-guanine phosphoribosylkirimase (HGPRT)
Disorder:Gaucher disease
Affected Gene:acid β-glucosidase (glucocerebrosidase)
Disorder:Familial hypercholesterolemia (FH)
Affected Gene:LDL receptor
FOTO Jumlah kopi DNA yang dihasilkan melalui proses PCR
FOTO The Ligase Chain Reaction (LCR)
FOTO LCR untuk menganalisis lokus sel sabit.
FOTO Skrining dgn berlabel nukleotida diubah yang dikenali oleh antibodi
FOTO Kloning DNA genom pada Vektor YAC
FOTO Representasi diagram dari vektor YAC
biasa digunakan untuk mengkloning DNA genom. Vektor
berisi telomeres ragi (TEL), sebuah sentromer (CEN), penanda dipilih (URA3), dan mandiri
urutan mereplikasi (ARS) serta urutan plasmid bakteri untuk seleksi antibiotik dan replikasi
dalam E. coli.
FOTO Respresentation diagram dari analisis RFLP untuk kehadiran lokus sel sabit. Genomik DNA diisolasi dan dicerna dengan enzim restriksi MstII. Satu MstII situs hilang di lokus sel sabit. DNA ini lalu dihapuskan dan dianalisa dengan probe β-globin-spesifik sesuai dengan urutan pada akhir 5'-gen. masing masing homozigot untuk gen globin normal akan menampakkan sebuah band hibridisasi tunggal karena kedua gen ibu dan ayah tidak akan terpengaruh. Heterozigot akan
menampakkan band band normal dan sel sabit gen yang lebih besar. Homozigot sel sabit masing masing akan menampakkan sebuah band hibridisasi tunggal yang lebih besar.
FOTO Protokol Sanger sekuensing DNA memakai dideoxynucleotides (ddNTPs) untuk menghentikan perpanjangan rantai DNA dari template kloning selama sintesis in vitro. Sintesis diawali dengan memakai primer oligonukleotida tertentu. Selama reaksi sintesis nukleotida radioaktif (biasanya dATP) dimasukkan ke dalam untaian elongating. Empat reaksi terpisah dilakukan secara bersamaan, masing-masing berisi semua 4 dNTP dan ddNTP tunggal. Semakin tinggi konsentrasi ddNTP perpanjangan lebih sering rantai akan ditutup sehingga dapat mengatur
tingkat informasi urutan diperoleh dengan memvariasikan dNTP / rasio ddNTP. Menyusul reaksi ekstensi hasil yang diselesaikan dengan elektroforesis pada gel (urea) denaturing poliakrilamida. Hasil yang diperoleh saat gel dikeringkan dan terpapar film x-ray. Pita (band) dekat bagian bawah gel adalah hasil reaksi pendek (yaitu yang paling dekat dengan ujung 3'-primer) dan pita (band) pling atas adalah hasil yang terpanjang.
