DNA kloning


















 DNA kloning

metode terapi gen adalah  rekayasa genetika, untuk penyakit genetik permanen pada tingkat kromosom atau gen dengan pemberian suatu fragmen DNA. Fokus terapi gen pada  penyakit yang dipicu kerusakan  satu gen,  tehnik  biologi molekuler  untuk melacak  urutan DNA  dari mikroorganisme tertentu ,  ini memungkinkan untuk dipakai sebagai sarana diagnosa,  Tehnik itu  dinamakan Polymerase Chain Reaction (PCR), yang sudah pernah  dipakai untuk  skrining  penderita infeksi ,Biologi molekuler bisa dikembangkan sebagai alat untuk diagnosa  bermacam macam metode bisa dimanfaatkan untuk dunia kedokteran antara lain kloning, terapi gen, PCR, SSCP, RFLP,

 memakai molekul untuk  pemanfaatan bermacam macam metode biologi molekuler dalam analisa penyakit , gen , analisa  penyakit bawaan , fungsi gen

dengan adanya   perkembangan DNA rekombinan dan metode kloning , Dasar DNA

rekombinan  mengacu   pada mencampur ulang fragmen DNA yang berbeda beda ,  kloning  mengacu pada proses penyusunan ulang  beberapa salinan molekul DNA, Mekanisme  untuk menghasilkan molekul rekombinan dengan  melibatkan cara cara  penyisipan fragmen fragmen  DNA, eksogen (circular double stranded DNA) berasal vektor plasmid atau bakteriofag (virus yang menginfeksi bakteri) berbasis vektor , 

Vektor mengacu pada molekul DNA yang  dipakai untuk membawa atau mengangkut DNA yang diinginkan ke dalam sel , 




TEKNOLOGI MOLEKULER DNA


 Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk memperkuat DNA jutaan kali lipat, dalam waktu singkat dengan replikasi berulang template, dengan 

memakai set tertentu dalam vitro oligonukleotida sintesis untuk sintesis DNA

prima,  Desain  tergantung pada urutan DNA yang diinginkan untuk dianalisa, metode ini dilakukan melalui 50  siklus ,pencairan template pada

suhu tinggi, yang memungkinkan primer untuk  urutan gratis dalam template

dan lalu mereplikasi template dengan DNA polimerase. Proses ini sudah otomatis dengan memakai DNA polimerase termostabil diisolasi dari bakteri yang tumbuh di ventilasi termal di laut atau air panas, Selama putaran pertama replikasi satu salinan DNA diterjemahkan menjadi dua salinan dan seterusnya memicu peningkatan eksponensial jumlah salinan dari urutan yang ditargetkan oleh primer. Sesudah hanya 20 siklus satu salinan DNA diperkuat lebih dari 2.000.000 kali lipat. hasil  dari reaksi PCR dianalisa   dengan pemisahan dalam gel agarosa

diikuti oleh bromida pewarnaan dan visualisasi dengan transillumination ultraviolet  Atau, dNTP radioaktif bisa ditambahkan untuk PCR dalam rangka untuk

menyatukan  label ke dalam hasil   ,  hasil dari PCR yang divisualisasikan oleh paparan gel untuk film x-ray. Keuntungan memakai radiolabeling pada hasil PCR adalah bisa meningkatkan kuantitas tingkat hasil amplifikasi , Jumlah salinan  DNA yang dihasilkan melalui proses PCRReaksi berantai polimerase bisa dipakai untuk memperkuat baik ganda dan beruntai tunggal (contohnya hasil dari reaksi transkripsi terbalik, RT-PCR) DNA.

Template dicampur dengan primer khusus atau merosot, dNTP, buffer polimerase

termasuk DNA polimerase MgCl2 dan termostabil. Template adalah didenaturasi pada suhu tinggi ( 95 ° C) dan lalu didinginkan ke suhu rendah ,

memungkinkan primer mengikat. Suhu reaksi lalu dinaikkan ,

 untuk DNA polimerase ( 72 ° C) dimana primer diperluas sepanjang

template. Rangkaian langkah ini dilakukan 20 sampai  30 kali mengarah ke amplifikasi  eksponensial dari template target. Amplifikasi ini  besar , hasil reaksi

bisa divisualisasikan berikut elektroforesis gel , 

PCR bisa dipakai dalam analisa gen penyakit dengan  memperkuat  jumlah terdeteksi fragmen khusus DNA. Amplifikasi fragmen dari gen penyakit

mungkin lebih besar, karena insersi, atau lebih kecil, karena penghapusan, amplifikasi DNA dengan PCR memungkinkan analisa gen penyakit dalam contoh bahan  sangat kecil . contohnya, hanya sedikit  sel janin perlu diekstraksi dari cairan ketuban untuk menganalisa keberadaan gen penyakit tertentu,  mutasi   titik tunggal bisa dideteksi dengan metode PCR direkayasa seperti reaksi berantai ligase (LCR) dan polimorfisme konformasi PCR-tunggal-untai (PCR-SSCP) analisa. metode PCR juga bisa dipakai untuk mengetahui  tingkat ekspresi gen dalam contoh bahan yang sangat kecil , contohnya jaringan atau sel-sel dari tubuh. metode ini dinamakan reverse transcription-PCR (RT-PCR) ,



Contoh kelainan genetik yang bisa terdeteksi oleh PCR 


disease   : β-Thalassemia 

affected gene

 :  mutations in β-globin gene that result in loss of

 synthesis of protein


disease   : Hemophilia A 

affected gene

 :  Factor VIII


disease   : Hemophilia B 

affected gene

 :  Factor IX


disease   : von Willebrand disease 

affected gene

 :  von Willebrand factor (vWF)


disease   : Severe-combined

immunodeficiency, SCID

affected gene

  :   adenosine deaminase (ADA)


disease   : Lesch-Nyhan syndrome 

affected gene

 :  hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase

(HGPRT)


disease   : α1-Antitrypsin deficiency 

affected gene

 :  α1-Antitrypsin


disease   : Cystic fibrosis

affected gene

 :   cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR)

protein


disease   : Fabry disease

affected gene

 :   α-galactosidase


disease   : Gaucher disease 

affected gene

 :  acid β-glucosidase (glucocerebrosidase)


disease   : Sandhoff disease 

affected gene

 :  hexosaminidase A and B


disease   : Tay-Sachs disease 

affected gene

 :  hexosaminidase A


disease   : Familial hypercholesterolemia

(FH)

affected gene

 :   LDL receptor


disease   : Glucose-6-phosphate

dehydrogenase deficiency 

affected gene

 :  glucose-6-phosphate dehydrogenase


disease   : Maple syrup urine disease

affected gene

 :   branched-chain α-keto acid dehydrogenase


disease   : Phenylketonuria (PKU) 

affected gene

 :  phenylalanine hydroxylase


disease   : Ornithine transcarbamylase

deficiency 

affected gene

 :  ornithine transcarbamylase


disease   : Retinoblastoma (Rb)

affected gene

 :   RB gene product, pRB


disease   : Sickle-cell anemia

affected gene

 :   point mutation in β-globin


PCR-dimediasi jenis cDNA tertentu dalam reaksi RT. cDNA yang dihasilkan selama

reaksi RT adalah representasi ke pola gen yang sedang diekspresikan pada saat

ekstraksi RNA.

Total RNA seluler bisa diekstraksi dari jaringan atau sel melalui bermacam macam

metode dan dipakai sebagai template untuk RT, isolasi RNA pertamakali memakai primer acak. Sebuah alikuot kecil reaksi RT ini lalu  ditambahkan ke reaksi PCR mengandung primer khusus untuk melakukan amplifikasi, hasil-hasil dari RT-PCR bisa lalu divisualisasikan seperti dijelaskan di atas untuk PCR standar ,


Banyak kelainan bawaan akibat perubahan nukleotida tunggal pada area

kritis dari gen yang terpapar (contohnya anemia sel sabit). metode PCR-SSCP bisa

mendeteksi mutasi gen tunggal karena mobilitas konformasi diubah dari untaian

tunggal DNA (dalam gel elektroforesis) membawa mutasi relatif terhadap untaian wild  type yang normal. Primer PCR khusus dibuat sesuai urutan gen suatu penyakit   untuk mengetahui mutasi dengan cara amplifikasi DNA melalui PCR. Amplifikasi yang sama pada gen wild type. Kedua untai hasil PCR wild type akan bermigrasi berbeda dibandingkan dengan 2 untai hasil PCR mutan. Bahkan mutasi titik tunggal  memicu  untai DNA amplifikasi yang ada di konformasi

 berbeda yang mengubah mobilitas mereka saat di jalankan  pada gel

elektroforesis non-denaturing,  Cara memvisualisasikan hasil PCR pada gel elektroforesis adalah dengan melakukan  nukleotida radioaktif  atau label radioaktif  yang dimasukkan ke dalam  hasil PCR. hasil PCR dipisahkan dalam gel poliakrilamid dan divisualisasikan  pada film x-ray. pasien yang homozigot wild type pada lokus yang dianalisa akan memperlihatkan dua band yang berbeda pada gel seperti  homozigot mutan. Namun, karena perubahan nukleotida hasil PCR mutan akan bermigrasi dengan mobilitas yang berbeda dalam gel,  pasien yang heterozigot akan memperlihatkan pola yang terdiri dari semua 4 band,


PCR-SSCP analisa gen sabit β-globin dan  sel normal , Mutasi A ke T diperlihatkan dengan warna biru. mutasi PCR diperkuat dan hasil dipisahkan pada gel poliakrilamid non-denaturing. hasil  PCR dari lokus jenis wild type dan lokus sel sabit akan bermigrasi berbeda disebabkan konformasi urutan-khusus. Normal akan menampilkan dua band sebagai akan homozigot sel sabit pasien (meskipun dengan ukuran yang berbeda dari normal) homozigot. pasien heterozigot

pada lokus sel sabit akan menampilkan 4 band,


Reaksi Rantai ligase adalah metode yang memungkinkan deteksi mutasi

titik tunggal pada gen penyakit. metode ini memanfaatkan DNA ligase termostabil

untuk menyambung oligonukleotida (oligos) yang berdekatan secara sempurna. 2

set oligos dirancang untuk annealing ke salah satu untai gen di lokasi mutasi, set kedua dari dua anneals oligos ke untai lainnya. Para oligos dirancang sedemikian rupa sehingga mereka hanya akan benar-benar anil ke urutan wild type. Contoh yang diperlihatkan di bawah ini untuk mutasi sel sabit, nukleotida 3 'satu oligo di masing  masing pasangan sesuai , Ketidaksesuaian ini  mencegah anil dari oligos berbatasan langsung dengan satu sama lain, oleh sebab  itu ligase DNA tidak akan meligase dua oligos masing-masing pasangan bersama-sama.

Dengan urutan wild type oligo pasangan yang sedang diligasi menjadi target bersama untuk anil di oligos dan, karenanya, memicu amplifikasi eksponensial dari

target wild type.  bahwa pengetahuan urutan sebelumnya diperlukan untuk

mendeteksi mutasi titik pada gen penyakit, metode LCR dipakai untuk diagnosa 

adanya alel mutan pada pasien risiko tinggi .kloning

Setiap fragmen DNA bisa digandakan sesudah dimasukkan ke dalam vektor

yang sesuai untuk transformasi bakteri sel host. kloning mengacu pada hasil

jumlah besar molekul DNA identik dan biasanya melibatkan pemakaian sel bakteri

sebagai sel host untuk DNA, walaupun kloning bisa dilakukan dalam sel eukariotik

juga. kloning cDNA mengacu pada hasil suatu perpustakaan DNA kloning  yang mewakili semua mRNA dalam sel atau jaringan tertentu , kloning genom mengacu pada hasil suatu perpustakaan DNA kloning mewakili seluruh genom suatu organisme tertentu. Dari salah satu dari jenis DNA library bisa berasal dari isolat (dengan bermacam macam protokol skrining) suatu.cDNA clone tunggal atau gen.

Dalam rangka untuk mengkloning baik cDNA atau salinan gen vektor diperlukan

untuk membawa DNA kloning. Vektor yang dipakai dalam biologi molekul dari dua kelas  dasar. Satu kelas vektor berasal dari plasmid bakteri, plasmid adalah DNA circuler ditemukan  pada bakteri yang bereplikasi secara autosomal dari genom inang. DNA ini pertama kali diketahui karena plasmid membawa gen resistensi antibiotik. Gen-gen resistensi antibiotik ditemukan pada plasmid dipakai dalam modern plasmid vitro direkayasa untuk  pemilihan bakteri yang sudah diambil plasmid yang berisi DNA , Plasmid terbatas di dalam bentuk fragmen  pasangan  DNA kurang dari 10.000 (pb) bisa digandakan,  Dalam fragmen praktek sekitar 5.000 bp adalah batas ,

Jenis lain dari vektor berasal dari bakteriofag (virus bakteri) lambda. Virus ini mampu baik lysogeny (integrasi ke dalam genom inang) dan lisis (infeksi diikuti oleh lisis dari hostyang terinfeksi). Gen yang diperlukan untuk lysogeny sudah dihapus dari vektor lambda yang berbasis  memungkinkan hanya siklus hidup litik untuk mengambil tempat.Keuntungan untuk vektor lambda berbasis adalah bahwa mereka bisa membawa fragmen DNA hingga 25.000 bp. Dalam analisa genom pasien bahkan vektor lambda berbasis membatasi dan kromosom ragi buatan (YAC) sistem vektor sudah dikembangkan untuk

kloning DNA fragmen sampai dengan 500.000 bp ,

Complimantary DNA (cDNA) dibuat dari mRNA dari sebuah sel oleh beberapa metode yang terkait. Masing-masing metode terdiri dari transkripsi balik pertama dari mRNA diikuti oleh sintesis dari kedua untai DNA dan penyisipan dari cDNA-double stranded menjadi baik vektor plasmid atau lambda untuk kloning , Proses ini  menciptakan sebuah perpustakaan cDNA clone yang mewakili masing-masing spesies mRNA. Skrining klon cDNA bisa dilakukan dengan memakai asam nukleat atau probe  protein-based (protein atau antibodi). Skrining cDNA juga dapt dilakukan melalui assay  biologis dari hasil yang dihasilkan oleh cDNA kloning ,

Proses untuk hasil dan kloning cDNA. Contoh ini memperlihatkan pemakaian adaptor-primer  khusus berisi urutan untuk enzim restriksi NotI di samping (T) poli untuk anil ke ekor (A) poli  RNA.   dimungkinkan  hanya memakai poli (T), atau poli (T) dengan situs  pembatasan lain atau primer acak (campuran oligos yang mengandung urutan acak) untuk  memulai reaksi untai pertama cDNA. Dalam beberapa kasus poli (T) priming tidak  memungkinkan untuk perpanjangan cDNA ke ujung 5'-dari RNA, pemakaian primer acak bisa  mengatasi masalah ini karena untai sintesis pertama sepanjang mRNA. metode ini memperlihatkan ligasi adapter EcoRI diikuti oleh EcoRI dan pencernaan NotI. Proses ini

memungkinkan cDNA untuk  digandakan dalam satu arah, dinamakan kloning terarah. Skrining dengan berlabel dengan nukleotida diubah yang dikenali oleh antibodi khusus dan dideteksi oleh tes kolorimetri atau chemiluminescent. Probe asam nukleat bisa dihasilkan dari DNA (termasuk oligonukleotida sintetik, oligos) atau RNA.  Probe asam nukleat bisa diberi label radioaktif atau protein, antibodi atau dengan uji  biologis adalah mekanisme untuk analisa ekspresi protein dari cDNA kloning dan  diberi istilah ekspresi kloning ,


Mayoritas kloning genom memakai sistem berbasis vektor lambda. Sistem

ini vektor mampu membawa 15-25,000 bp DNA. kloning fragmen sedikit lebih besar dari DNA genom bisa dilakukan memakai sistem plasmid-lambda vektor

chimeric dinamakan sebuah kosmid. vektor Kosmid hanya berisi cos (kohesif) ujung  genom lambda (diperlukan untuk kemasan DNA menjadi partikel virus yang menular)  bersama dengan gen resistensi antibiotik plasmid dan asal replikasi DNA. Sejak sekitar  30.000 pb DNA lambda sudah dihapus dari vektor kosmid, lebih besar fragmen DNA  genom bisa digandakan. Fragmen DNA genom yang berukuran lebih besar bisa dikloning   ke vektor YAC , 

Genomik DNA bisa diisolasi dari sel atau jaringan untuk kloning. DNA

genom pertama kali dilisis oleh enzim restriksi menghasilkan fragmen dengan ukuran  yang optimal untuk vektor yng akan dipakai untuk kloning.  bahwa

beberapa pasang basa gen lebih panjang dibandingkan   yang bisa dimasukkan ke

konvensional atau vektor lambda kosmid, kloning  yang di insersikan dari genomic library  harus over lapping ,  Untuk menghasilkan kloning 

tumpang tindih, DNA hanya sebagian dilisis oleh enzim restriksi. Ini berarti bahwa

tidak setiap situs restriksi, hadir dalam semua salinan  gen dalam

penyusun   urutan DNA yang bereplikasi. DNA sebagian dilisis lalu ukuran  ditentukan oleh bermacam macam metode (contohnya elektroforesis gel atau sentrifugasi gradien)

sebelum kloning. Skrining genom library dilakukan dengan probe berbasis asam

nukleat. Namun, mereka bisa disaring dengan protethat diketahui urutan pita DNA

khusus (contohnya faktor transkripsi) , 

Protokol DNA genomik khusus kloning digambarkan di bawah ini. Diagram

representasi dari gen hipotetis dalam penyiapan DNA genom. Kotak memperlihatkan ekson dan garis memisahkan kotak mewakili intron. Panah tebal memperlihatkan posisi situs enzim restriksi, contohnya Sau3AI. Sesudah enzim merestriksi parsial bermacam macam fragmen gen yang akan dihasilkan, 4 fragmen yang mungkin diperlihatkan. Fragmen di   ukuran 15-25 pasang kilobase (kbp) yang dimurnikan dengan elektroforesis gel atau sentrifugasi gradien dan diligasikan ke dalam vektor lambda. DNA itu  dikemas ke dalam partikel fag in vitro dan dipakai untuk menginfeksi E. Coli


YAC vektor memungkinkan kloning, dalam sel-sel ragi, fragmen DNA genom

yang memiliki panjang sekitar 500.000 pb. Vektor ini berisi beberapa elemen

kromosom ragi khas, maka YAC panjang. Vektor YAC mengandung sentromer ragi

(CEN), telomeres ragi (TEL), telomer adalah urutan tertentu yang hadir pada ujung

kromosom dan yang diperlukan untuk replikasi) dan ragi mandiri mereplikasi urutan

(ARS)  ARSes Ragi pada dasarnya asal-usul yang  berfungsi dalam replikasi sel-sel ragi mandiri dari replikasi asal replikasi kromosom ragi. vektor YAC juga mengandung gen, (URA3 contohnya, sebuah gen yang terlibat dalam sintesis urasil) yang memungkinkan pemilihan sel ragi yang sudah diambil vektor,  Dalam rangka untuk menyebarkan vektor dalam sel bakteri, sebelum penyisipan DNA genom, vektor YAC mengandung asal replikasi bakteri dan penanda

dipilih bakteri seperti fro gen resistensi ampisilin , 

Dalam kloning DNA genomik dalam vektor YAC khas, DNA genom sebagian

dicerna dengan EcoRI dan fragmen rata rata   400-500 pasang kilobase (kbp) yang

dimurnikan dengan gel elektroforesis lapangan berdenyut, PFGE. Vektor YAC dicerna dengan EcoRI dan BamHI yang menempatkan urutan telomer pada ujung vektor linierisasi. Fragmen BamHI kecil dipisahkan dari sisa vektor YAC dengan

elektroforesis gel standar. DNA genomik lalu diligasi ke vektor dan lalu  dipakai untuk mentransformasi sel-sel ragi ,


Representasi diagram dari vektor YAC biasa dipakai untuk mengkloning DNA genom. Vektor berisi telomeres ragi (TEL), sebuah sentromer (CEN), penanda dipilih (URA3), dan mandiri urutan mereplikasi (ARS) dan urutan plasmid bakteri untuk seleksi antibiotik dan replikasi dalam E. coli.


analisa cDNA kloning dan gen melibatkan beberapa metode,  Karakterisasi

awal biasanya melibatkan pemetaan jumlah dan lokasi situs enzim restriksi berbeda. Informasi ini bermanfaat untuk sequencing DNA karena menyediakan sarana untuk merestriki kloning  menjadi fragmen khusus untuk sub-kloning, sebuah proses yang melibatkan kloning fragmen dari DNA kloning tertentu. Sesudah DNA sepenuhnya  ditandai kloning  cDNA bisa dipakai untuk menghasilkan RNA in vitro dan RNA  diterjemahkan secara in vitro untuk karakterisasi protein. kloning  cDNA juga bisa dipakai sebagai probe untuk menganalisa struktur gen dengan Southern blotting  atau menganalisa ukuran RNA dan pola ekspresi oleh Northern blotting. Northern  blotting juga adalah alat yang bermanfaat dalam analisa organisasi ekson-intron klon gen karena hanya fragmen gen yang mengandung ekson akan mengawinkan silang ke

RNA pada noda itu ,

Southern Blotting: Southern blotting adalah analisa struktur DNA

ditempelkan pada fase berikut lampiran solid. Tahap pertama adalah merestriksi DNA  dengan enzim restriksi maka fragmen DNA yang dihasilkan dipisahkan dalam gel agarosa. Gel diperlakukan dengan NaOH untuk mengubah sifat sesuatu benda DNA, maka NaOH ini dinetralkan. DNA dikirim dari gel ke nitroselulosa atau nilon kertas filter dengan baik difusi kapiler atau di bawah arus listrik , DNA ini

tetap filter dengan baking atau terapi sinar ultraviolet. Filter lalu bisa

dideteksi untuk kehadiran fragmen DNA yang diberikan dengan cara radioaktif atau  bukan -bermacam macam radioaktif.Northern Blotting : Northern blotting melibatkan analisa RNA dengan melakukan penempelan pada fase solid. RNA ini berukuran oleh gel elektroforesi  lalu dikirim ke nitroselulose atau nilon kertas filter untuk Southern blotting.

Probing filter untuk RNA tertentu dilakukan mirip dengan probe Southern blot ,

Western Blotting: Western blotting melibatkan analisa protein yang

dilekatkan pada fase solid. Protein dipisahkan dengan ukuran-PAGE elektroforesis

SDS dan dikirim ke nitroselulose atau filter nilon. Filter ini lalu diperiksa

dengan antibodi yang diajukan terhadap protein tertentu.


Variabilitas genetik pada lokus tertentu (gen) perubahan dasar akibat kecil

bahkan bisa mengubah pola fragmen restriksi enzim pencernaan yang bisa

dihasilkan. perubahan patogen untuk genotipik bisa karena penghapusan atau sisipan di dalam gen yang dianalisa atau bahkan substitusi nukleotida tunggal yang bisa  membuat atau menghapus situs enzim restriksi pengakuan , 

analisa RFLP mengambil keuntungan dari ini  dan memanfaatkan Southern

blotting direstriksi oleh endonuclease DNA genom untuk mendeteksi pola keluarga  dari fragmen gen yang diberikan, terdeteksi dengan penapisan Southern blotting  dengan probe sesuai dengan gen yang diinginkan. Sebuah contoh klasik dari penyakit  yang terdeteksi oleh RFLP adalah anemia sel sabit ,Hasil sabit anemia sel (pada tingkat gen) dari perubahan nukleotida tunggal (A

T) pada kodon 6 dalam gen β-globin. Perubahan ini menyebabkan glutathione (G)

untuk val (V) substitusi asam amino, sementara pada saat yang sama menghapuskan pembatasan situs MstII. Akibatnya probe gen β-globin bisa dipakai untuk mendeteksi MstII fragmen restriksi.  bahwa ada dua salinan dari setiap  gen di semua sel pasien. RFLP mendeteksi kedua salinan: yang Alel terpengaruh dan alel terpengaruh.  Ukuran variabilitas dalam fragmen terdeteksi dalam silsilah keluarga memperlihatkan perbedaan dalam pola situs restriksi dalam dan di sekitar gen yang sedang dianalisa,  Pola RFLP yang diwariskan dan memisahkan dalam mode Mendel sehingga memungkinkan pemakaiannya dalam genotip seperti dalam kasus nvestigasi kriminal.

Bentuk lain dari polimorfisme DNA terdeteksi oleh hasil pemetaan klasik

RFLP dari variasi diwariskan dalam jumlah elemen DNA tandem urutan yang

berulang 2-60 bp panjang. Jumlah mengulangi juga variabel 2-40 eksemplar. Elemen  ini dinamakan berulang tandem variabel nomor (VNTR). saat pencernaan enzim restriksi memotong DNA mengapit VNTRs, panjang fragmen yang dihasilkan akan bervariasi tergantung pada jumlah mengulang pada lokus tertentu. Banyak lokus VNTR berbeda sudah diketahui dan sangat bermanfaat untuk analisa sidik jari DNA seperti dalam kasus identitas forensik dan ayah.


Respresentation diagram dari analisa RFLP untuk kehadiran lokus sel sabit. Genomik DNA diisolasi dan dicerna dengan enzim restriksi MstII. Satu MstII situs hilang di lokus sel sabit. DNA ini lalu dihapuskan  dan dianalisa dengan probe β-globin-khusus sesuai dengan urutan pada akhir 5'-gen. pasien homozigot untuk gen globin normal akan memperlihatkan sebuah band hibridisasi tunggal karena kedua gen ibu dan ayah tidak akan terpengaruh. Heterozigot akan

memperlihatkan band band normal dan sel sabit gen yang lebih besar. Homozigot sel sabit pasien  akan memperlihatkan sebuah band hibridisasi tunggal yang lebih besar.

 metode konvensional untuk sequencing dengan metode sekuensing Maxam dan Gilbert, bergantung pada replikasi nukleotida atau DNA dan tidak secara rutin dipakai lagi. metode enzimatik, Sanger sequencing, melibatkan pemakaian dideoxynucleotides (2 ', 3'-dideoksi) yang mengakhiri sintesis DNA dan karena itu dinamakan sekuensing terminasi rantai dideoksi


Protokol Sanger sekuensing DNA memakai dideoxynucleotides (ddNTPs) untuk

menghentikan perpanjangan rantai DNA dari template kloning selama sintesis in vitro. Sintesis diawali dengan memakai primer oligonukleotida tertentu. Selama reaksi sintesis nukleotida  radioaktif (biasanya dATP) dimasukkan ke dalam untaian elongating. Empat reaksi terpisah  dilakukan secara bersamaan, masing-masing berisi semua 4 dNTP dan ddNTP tunggal. Semakin tinggi konsentrasi ddNTP perpanjangan lebih sering rantai akan ditutup sehingga bisa mengatur

tingkat informasi urutan diperoleh dengan memvariasikan dNTP / rasio ddNTP. Menyusul reaksi  ekstensi hasil yang diselesaikan dengan elektroforesis pada gel (urea) denaturing  poliakrilamida. Hasil yang diperoleh saat gel dikeringkan dan terpapar film x-ray. Pita (band) dekat bagian bawah gel adalah hasil reaksi pendek (yaitu yang paling dekat dengan ujung  3'-primer) dan pita (band) pling atas adalah hasil yang terpanjang.


analisa Microarray melibatkan pemakaian apa yang biasanya dinamakan

"chips gen" untuk menentukan ekspresi set besar gen pada saat yang sama dalam

percobaan tunggal. Gene chip bisa dibeli dari beberapa perusahaan yang berbeda,

contohnya Affymetrix, atau mereka bisa kustom dipersiapkan di laboratorium dengan peralatan yang sesuai. Chip gen Affymetrix diciptakan melalui lampiran kovalen oligonukleotida sintetik (oligos) ke permukaan kecil ,ada 20 atau lebih oligos berbeda pada chip yang sesuai dengan daerah yang berbeda tiap gen yang akan dianalisa, satu set oligos yang masing-masing berisi ketidaksesuaian nukleotida ditambahkan  sebagai kontrol negatif untuk setiap gen. Teknologi menciptakan chip gen sehingga bisa ada 10's ribu gen yang berbeda diwakili pada satu chip kira-kira 2 cm persegi, 



Meskipun ada banyak dipakai untuk chip gen, percobaan yang  melibatkan perbandingan ekspresi gen pada chip antara dua contoh bahan, contohnya sel

kanker dan sel normal. Pengujian dilakukan dengan menyusun RNA dari contoh bahan masing-masing dan mengubah RNA cDNA di hadapan nukleotida neon. contohnya,  satu RNA contoh bahan diubah menjadi cDNA dengan nukleotida neon hijau dan contoh bahan RNA lainnya diubah menjadi cDNA di hadapan sebuah nukleotida neon merah. Ini "tag" olahan cDNA dinamakan "target" dan jumlah yang sama dari masing-masing sasaran.persiapan dicampur bersama dan lalu hibridisasi untuk chip gen. Sesudah pencucian dari target unhybridized dan pengolahan gambar dari satu chip akan melihat bintik-bintik yang hanya hijau, hanya merah, atau warna di antara yang adalah campuran dari beberapa merah dan hijau,, beberapa tempat akan menjadi kuning, Bintik-bintik merah yang hanya

memperlihatkan bahwa gen itu terungkap hanya di sumber target berlabel merah dan sebaliknya untuk bintik hijau. Intermediate warna memperlihatkan perbedaan tingkat  ekspresi gen pada kedua contoh bahan. memakai komputer untuk menentukan satu hibridisasi intensitas akan memperoleh  gambaran yang lengkap dari tingkat ekspresi dari masing-masing gen pada chip di setiap persiapan RNA.


Transgenesis mengacu pada proses mengenalkan gen eksogen ke dalam

garis kuman organisme. Transgenesis percobaan pertama yang berhasil dilakukan pada tikus. Satu percobaan relatif dikenal terlibat pengenalan gen hormon pertumbuhan tikus ke dalam garis kuman mencit. Tikus transgenik ini tumbuh dua kali ukuran normal mereka.

Untuk membuat binatang transgenik gen  harus diwariskan dari generasi ke generasi, yaitu harus diwariskan pada keturunan bakteri. Untuk mencapai

ini dengan tikus atau hewan ternak, vektor yang mengandung gen 

dengan unsur-unsur  yang sesuai (contohnya promotor β-lactoglobulin jika

ekspresi transgen dalam susu yang diinginkan) yang disuntikkan ke dalam inti telur  dibuahi. Telur-telur itu lalu dipindahkan ke dalam rahim perempuan

menerima untuk pengembangan keturunan transgenik potensial. Dalam rangka untuk  menguji hewan yang dihasilkan untuk saluran transmisi bakteri dari transgen DNA  kromosom keturunan mereka diuji untuk kehadiran transgen , 

Saat ini proses transgenesis sedang dipakai baik di industri tanaman dan

ternak. Tujuan dari sebagian besar percobaan ini adalah untuk menghasilkan tanaman dan hewan yang lebih tahan terhadap penyakit dan infeksi , Namun, beberapa hewan pertanian transgenik seperti domba dan sapi

sedang dikembangkan dalam rangka untuk memperoleh tingkat tinggi ekspresi protein  terapi penting selama sintesis susu , ini memungkinkan beberapa

besar protein dari bunga yang akan dimurnikan dari susu hewan transgenik.


Pada biasanya terapi penyakit dilakukan berdasar timbulnya gejala

tidak terkecuali untuk penyakit genetik seperti kanker. sudah diketahui bahwa suatu  penyakit terjadi akibat ekpresi gen yang menghasilkan protein tidak normal. Dengan  adanya projek genetik pasien (Human Genetic Project) maka sudah berhasil  diketahui seluruh gen yang berada pada 22 pasang kromosom autosomal dan..sepasang kromosom sex ,

Terapi gen atau gene therapy adalah salah satu metode terapi

penyakit genetik permanen dengan pemberian suatu fragmen Deoxyribo nuclease acid  (DNA). Prinsip dasar terapi gen adalah rekayasa genetika, proses ini dilakukan dengan  cara menggabungkan gen normal dengan vector DNA sebagai vehicle lalu  diinsersikan pada kromosom yang memiliki gen tidak normal. Terapi gen ditujukan untuk  memperbaiki kesalahan metabolisme pada penyakit kelainan genetic, kanker, penyakit.infeksi, atau kelainan autoimun , 

Mengapa terapi gen bisa dilakukan antara lain : DNA diketahui sebagai

materi pembawa informasi genetik, struktur DNA dan kode genetic sudah bisa

diketahui, selain itu ditemukan pemotong DNA yaitu enzim endonuklease, metode

rekombinan gen (recombinant DNA) sudah bisa dilakukan dan hasil campur ulang

DNA bisa dihasil pada sel bakteri. Alasan lainnya adalah adanya proses

cloning dan penggandaan DNA, maping DNA pasien sudah diketahui sehingga

proses terapi gen sudah dimulai sejak tahun 1990.

Dua macam cara melakukan terapi gen yaitu gen terapi pada sel somatik dan

terapi pada sel rehasil. Terapi sel somatic (somatic cell) lebih mudah dilakukan

dan secara etika bisa diterima namun koreksi hanya terjadi pada satu generasi yaitu

hanya pada pasien yang mengalami terapi tidak untuk keturunannya. Terapi sel

rehasil (Germ-line therapy) secara metode sulit dilakukan dan secara etika sulit

diterima. Terapi gen pada sel rehasil bisa memperbaiki atau memperbaiki gen

pada semua generasi baik pasien maupun keturunannya , Dari beberapa analisa yang sudah dilakukan terapi sel rehasilsi  hanya dilakukan pada hewan.

Prinsip dasar terapi gen adalah : gene addition dilakukan dengan cara

menambahkan gen normal namun gen rusak tetap ada, biasanya dilakukan untuk

pendekatan penyakit resesif ; gene replacement dilakukan dengan cara mengganti gen yang rusak ditujukan untuk penyakit dominan; sedang gene substraction  dilakukan untuk mencegah ekspresi gen, dengan cara terapi anti-sens atau terapi antigen ,

Proses terapi gen dilakukan melalui identifikasi gen normal dan tidak normal,

menghasilkan DNA rekombinan, memilih metode kirim gen normal (ex vivo atau in

vivo), dan memastikan regulasi ekspresi dari gen yang sudah dikirim ,

Metode kirim gen normal kedalam sel pasien bisa dilakukan diluar tubuh 

(ex vivo), metode ini dilakukan pada sel atau jaringan yang bisa dikeluarkan dan

dikembalikan ke tubuh pasien contohnya komponen system hemopoitik, kulit, dan sel

endothelial. kirim gen yang dilakukan langsung ke dalam sel atau jaringan pada

pasien dikenal dengan metode in vivo , Proses in vivo dilakukan

melalui  cara ,antaralain : 

-Memasukkan secara injeksi DNA yang sudah dikonjugasikan dengan

karier ke dalam DNA target. contohnya antibody dikonyugasikan dengan

asialoglycoprotein lalu dimasukkan ke dalam DNA target di organ hati.

-Memasukkan partikel bombardement yaitu DNA yang dilapisi komponen

metal lalu ditembakkan ke dalam sel ( otot, sel,limpa,hati, kulit, pankreas )

-Memasukkan DNA secara langsung memakai jarum suntik ke dalam

jaringan khusus; contohnya gen dystrophin disuntikkan langsung ke dalam sel otot  atau melalui infus masuk ke pembuluh darah,

-Memasukkan secara injeksi DNA yang sudah dilapisi lipid sehingga

bisa berikatan dengan sel atau di endositosis oleh sel,


penghantaran gen ke dalam sel pasien dilakukan melalui jasa virus. Virus bisa berfungsi sebagai vehicle yang menghantarkan DNA mencapai target sel yang diinginkan . bermacam macam virus yang bisa.dimanfaatkan untuk membantu proses terapi gen, antara lain :

- Virus Moloney murine leukemia (MoMLV) dimanfaatkan pada keganasan (malignant oncogen)

-  Virus Herpes simplex virus (HSV) dipakai untuk mencapai target central

nervous system (CNS) pada Latent infections in neurons

- Virus Retro, adalah virus bergenom RNA dimanfaatkan untuk membawa DNA

mencapai sel T pada severe combined immunodeficiency (SCID) atau

mencapai sel hepatosit pada familial hypercholesterolemia.

-  Virus Adeno adalah virus bergenom DNA dipakai untuk membawa DNA mencapai target sel epithelium nasal/bronkus atau kornea pada cystic fibrosis.

pengawasan ketat terapi gen dilakukan dengan cara ,antaralain: 

-Identifikasi mRNA dengan metode Reverse Trancriptase - Polyerase chain

reaction (RT-PCR) untuk mengetahui  proses transkripsi gen.

-  Imunoassay untuk  mengetahui   protein hasil translasi.

- Identifikasi gen dengan metode Polyerase chain reaction (PCR) untuk

mendeteksi keberadaan cDNA yang dimasukkan.

Uji-uji lain yang berkaitan dengan efek fisiologi sebagai akibat dari

penyakit genetikTerapi gen pertama dilakukan tahun 1999 dilakukan pada pasien pasien anak perempuan berusia 6 tahun yang mengalami SCID akibat defisiensi ADA. Penderita ini memiliki risiko tinggi terhadap infeksi oportunis dan malignancy. Gen ada adalah gen housekeeping yang regulasi tidak ketat dan sudah berhasil di cloning pada tahun 1983 ,

Melalui vektor retrovirus dilakukan gene replacement pada sel T normal.

Limfosit pasien anak itu dikultur secara in vitro lalu dimasukkan kedalam

tubuhnya dengan cara infus sel T yang gen ada nya sudah diperbaiki , 

Terapi gen diulang setiap 1-2 bulan pada tahun pertama terapi dan setiap 3 – 6

bulan pada tahun kedua. Sesudah tahun kedua pasien anak ini diperbolehkan rawat jalan dengan bermacam macam pengawasan ketat terhadap pembentukan antibodi , respons terhadap imunisasi , dan penurunan kejadian infeksi . Hasil terapi gen pada pasien anak itu adalah bebas sinusitis dan nyeri kepala dan dua tahun sesudah terapi tamat sekolah

.Transgenesis dengan pasien  memungkinkan untuk penghapusan gen

penyakit dalam populasi keturunan, Namun, teknis maupun isu-isu etis kemungkinan akan mencegah percobaan transgenik dilakukan dengan telur pasien , kemampuan untuk menggantikan gen penyakit yang dikenal

dengan salinan yang normal pada pasien menderita adalah tujuan akhir dari terapi

gen. protokol terapi gen pasien bertujuan untuk mengenalkan mengoreksi

salinan gen penyakit ke dalam sel somatik dari pasien yang terpapar , Ekspresi dari salinan  DNA yang benar dari gen terpengaruh dalam sel-sel

somatik mencegah penularan melalui garis kuman, dengan demikian, menghindari

banyak masalah etis dari transgenesis. ini analog dengan perlakuan terhadap

pasien dengan transplantasi organ atau jaringan , 

metode yang paling biasa dipakai dalam analisa terapi gen adalah pengenalan

gen diperbaiki menjadi sel-sel sumsum tulang, fibroblas kulit atau hepatosit. Vektor yang paling biasa dipakai berasal dari retrovirus dan hanya memanfaatkan daerah promotor transkripsional virus ini (yang LTRs) untuk mendorong ekspresi gen yangdiinginkan. Keuntungan dari sistem vektor retrovirus berbasis ekspresi yang terjadi.pada tipe sel paling ,

beberapa kelainan bawaan pasien sudah diperbaiki pada sel kultur dan

beberapa penyakit (contohnya SCID,melanoma maligna dan penyakit imunodefisiensi gabungan yang berat) 


Gangguan pasien Ditangani di Sel budidaya oleh Gene Terapi


Disorder:Phenylketonuria (PKU) 

Affected Gene:phenylalanine hydroxylase


Disorder:β-Thalassemia 

Affected Gene:β-Globin


Disorder:Hemophilia B 

Affected Gene:Factor IX


Disorder:SCID

Affected Gene: adenosine deaminase (ADA)


Disorder:SCID 

Affected Gene:purine nucleoside phosphorylase (PNP)


Disorder:Lesch-Nyhan syndrome 

Affected Gene:hypoxanthine-guanine phosphoribosylkirimase (HGPRT)


Disorder:Gaucher disease 

Affected Gene:acid β-glucosidase (glucocerebrosidase)


Disorder:Familial hypercholesterolemia (FH) 

Affected Gene:LDL receptor




FOTO  Jumlah kopi DNA yang dihasilkan melalui proses PCR

FOTO The Ligase Chain Reaction (LCR)

FOTO  LCR  untuk menganalisis lokus sel sabit.

FOTO  Skrining dgn berlabel  nukleotida diubah yang dikenali oleh antibodi

FOTO Kloning DNA genom pada Vektor YAC

FOTO  Representasi diagram dari vektor YAC

biasa digunakan untuk mengkloning DNA genom. Vektor

berisi telomeres ragi (TEL), sebuah sentromer (CEN), penanda dipilih (URA3), dan mandiri

urutan mereplikasi (ARS) serta urutan plasmid bakteri untuk seleksi antibiotik dan replikasi

 dalam E. coli.



FOTO  Respresentation diagram dari analisis RFLP untuk kehadiran lokus sel sabit. Genomik DNA diisolasi dan dicerna dengan enzim restriksi MstII. Satu MstII situs hilang di lokus sel sabit. DNA ini lalu dihapuskan  dan dianalisa dengan probe β-globin-spesifik sesuai dengan urutan pada akhir 5'-gen. masing masing homozigot untuk gen globin normal akan menampakkan sebuah band hibridisasi tunggal karena kedua gen ibu dan ayah tidak akan terpengaruh. Heterozigot akan

menampakkan band band normal dan sel sabit gen yang lebih besar. Homozigot sel sabit masing masing akan menampakkan sebuah band hibridisasi tunggal yang lebih besar.





FOTO  Protokol Sanger sekuensing DNA memakai dideoxynucleotides (ddNTPs) untuk  menghentikan perpanjangan rantai DNA dari template kloning selama sintesis in vitro. Sintesis  diawali dengan memakai primer oligonukleotida tertentu. Selama reaksi sintesis nukleotida  radioaktif (biasanya dATP) dimasukkan ke dalam untaian elongating. Empat reaksi terpisah dilakukan secara bersamaan, masing-masing berisi semua 4 dNTP dan ddNTP tunggal. Semakin tinggi konsentrasi ddNTP perpanjangan lebih sering rantai akan ditutup sehingga dapat mengatur

tingkat informasi urutan diperoleh dengan memvariasikan dNTP / rasio ddNTP. Menyusul reaksi ekstensi hasil yang diselesaikan dengan elektroforesis pada gel (urea) denaturing poliakrilamida. Hasil yang diperoleh saat gel dikeringkan dan terpapar film x-ray. Pita (band) dekat bagian bawah gel adalah hasil reaksi pendek (yaitu yang paling dekat dengan ujung 3'-primer) dan pita (band) pling atas adalah hasil yang terpanjang.