.jpeg)
.jpeg)
.jpeg)
bioteknologi
Meningkatnya kulitas hidup serta nilai-nilai budaya manusia itu
sendiri akan menuntut peningkatan dari kulitas kebutuhannya,
sedangkan pertambahan jumlah populasi manusia akan meningkatkan
kuantitas kebutuhan tersebut. Untuk memenuhi kebutuhan manusia
tersebut maka berkembanglah suatu kemajuan teknologi baru yang
memberikan kesempatan kepada manusia untuk menjadi arsitek
kehidupan yaitu Bioteknologi. Bioteknologi berasal dari kata “bio”
dan “teknologi” yang dapat diartikan sebagai penggunaan organisme
atau sistem hidup untuk memecahkan suatu masalah atau untuk
menghasilkan produk yang berguna.
Dalam kurun waktu 20 tahun terakhir ini, Bioteknologi telah
mengalami perkembangan sangat pesat. Di beberapa negara maju,
Bioteknologi mendapatkan perhatian serius dan dikembangkan
secara intensif dengan harapan dapat memberi solusi untuk
mengatasi berbagai permasalahan yang dihadapi manusia pada saat
ini maupun yang akan datang yang menyangkut kebutuhan pangan,
obat-obatan, penelitian, yang pada gilirannya semuanya bertujuan
untuk meningkatkan kesejahteraan hidup umat manusia.
1
Bioteknologi telah mengalami perkembangan yang menakjubkan
dan semakin banyak dimanfaatkan dalam kehidupan kita. Kemajuan
ini terutama ditunjang oleh perkembangan yang sangat pesat pada
bidang ilmu biologi molekuler dan teknologi rekayasa genetika.
Keunggulan bioteknologi dalam pertanian telah kita manfaatkan
dalam kehidupan sehari- hari dari teknik perbanyakan bibit unggul
dan tanaman bebas virus dengan memiliki teknik kultur
jaringan, perakitan varietas tanaman hasil rekayasa genetika.
Bioteknologi pada mikroorganisme, berhasil melipat gandakan
kemampuan produksi bakteri penghasil zat aktif untuk bahan
baku obat dengan teknik rekayasa genetika, begitu pula dengan
mikroba penghasil alkohol dan enzim tertentu. Selain itu, biologi
molekuler telah kita manfaatkan pula dalam peningkatan kualitas
kesehatan dengan memanfaatkan teknik vaksin, serta diagnostik
untuk penyakit-penyakit berbahaya maupun deteksi dini terhadap
kontaminasi mikroba patogen.
2
Pada modul ini akan dibahas mengenai materi bioteknologi
sebagai bahan pembelajaran untuk menngkatkan kemampuan dan
pengetahuan mahasiswa belajar mandiri. Selain itu modul ini juga
dapat menjadi rujukan mahasiswa dalam proses belajar.
B. Tujuan Pembelajaran
Adapun tujuan dari pembuatan modul ini adalah:
1. Mahasiswa mampu mengetahui mengenai Bioteknologi
2. Mahasiswa mampu menjelaskan mengenai cabang keilmuan
Bioteknologi
3. Mahasiswa mampu menjelaskan mengenai Bioteknologi
Konvensional
4. Mahasiswa mampu menjelaskan mengenai Bioteknologi
Modern
5. Mahasiswa mampu menjelaskan mengenai Struktur DNA
6. Mahasiswa mampu menjelaskan tentang pemanfaatan
aplikasi bioteknologi dari berbagai bidang
7. Mahasiswa mampu menjelasakn pembuatan Kultur
Tanaman
BIOTEKNOLOGI
Istilah bioteknologi untuk pertama kalinya dikemukakan oleh
Karl Ereky seorang insinyur Hongaria pada tahun 1917 untuk
mendeskripsikan produksi babi dalam skala besar dengan
memiliki bit gula sebagai sumber pakannya. Beragam batasan
dan pengertian dikemukakan oleh berbagai lembaga untuk
menjelaskan tentang bioteknologi. Beberapa diantaranya akan diulas
singkat sebagai berikut:
1. Menurut Bull et al. (1982), bioteknologi merupakan
penerapan asas-asas sains (ilmu pengetahuan alam) dan
rekayasa (teknologi) untuk pengolahan suatu bahan dengan
melibatkan aktivitas jasad hidup untuk menghasilkan
barang atau jasa.
2. Bioteknologi merupakan penerapan prinsip-prinsip ilmu
pengetahuan dan kerekayasaan untuk penanganan dan
pengolahan bahan dengan bantuan agen biologis untuk
menghasilkan bahan atau jasa.
3. Bioteknologi adalah teknik pendayagunaan organisme hidup
atau bagian organisme untuk membuat atau memodifikasi
suatu produk dan meningkatkan sifat tanaman atau hewan
atau mengembangkan mikroorganisme untuk penggunaan
khusus.
4. Menurut Primrose (1987), Secara lebih sederhana
bioteknologi merupakan eksploitasi komersial organisme
hidup atau komponennya seperti enzim.
5. Bioteknologi berasal dari dua kata, yaitu 'bio' yang
berarti makhuk hidup dan 'teknologi' yang berarti cara
untuk memproduksi barang atau jasa.
Berdasarkan terminologinya maka bioteknologi dapat diartikan
sebagai berikut:
4
1. “Bio” memiliki pengertian agen hayati yang meliputi:
Organisme (bakteri), jamur (ragi atau kapang), jaringan atau
sel (kultur sel tumbuhan atau hewan) dan komponen sub-
selulernya (enzim).
2. “Tekno” memiliki pengertian teknik atau rekayasa yaitu
segala sesuatu yang berkaitan dengan rancang-bangun,
Misalnya untuk rancang bangun suatu bioreaktor. Cakupan
teknik disini sangat luas antara lain teknik industri dan
kimia.
3. “Logi” memiliki pengertian ilmu pengetahuan alam (sains)
yang mencakup biologi, kimia, fisika, matematika. Ditinjau
dari sudut pandang biologi, maka bioteknologi merupakan
penerapan biologi molekuler, mikrobiologi, biokimia, dan
genetika.
B. Sejarah Bioteknologi
Bioteknologi dalam artian pemanfaatan mikroorganisme untuk
mengolah makanan dan minuman telah dikenal sejak jaman
dahulu sebelum masehi. Orang mesir kuno telah mengenal
pemanfaatan mikroorgansime untuk membuat bir, anggur, vinegar,
keju, yoghurt. Bioteknologi telah mengalami perkembangan sesuai
jamannya untuk memproduksi alkohol, penisilin, dan akhirnya
antibodi monoklonal.
Prospek ke depan, terdapat indikasi bahwa perkembangan
penerapan bioteknologi dalam segala bidang kehidupan akan
semakin meningkat dengan didukung oleh penemuan-penemuan
baru dan penerapan metode-metode baru. Kemajuan yang sangat
menggembirakan dalam bioteknologi adalah penerapan rekayasa
genetika dengan menyisipkan gen-gen tertentu yang dikehendaki
kedalamsel yang telah dikultur dengan tujuan untuk memproduksi
insulin dan/atau beberapa hormon pertumbuhan dalam skala besar.
Demikian pula penggunaan antibodi monoclonal sangat meluas
baik untuk penelitian maupun uji klinis termasuk diagnosis dan
bahkan upaya mencapai target spesifik untuk pengobatan.
5
Perencanaan strategis dalam Bioteknologi: kompetensi
menguasai bioteknologi dapat tercapai manakala pembinaan
sumber daya manusia diorientasikan pada kompetensi meneliti dan
menerapkan metode-metode mutakhir bioteknologi. Kemampuan
menguasai dan mengaplikasikan metode-metode mutakhir
bioteknologi seperti: kultur jaringan, rekayasa genetik, hibridoma,
kloning, dan polymerase chains reaction (PCR) secara prospektif
akan mampu menghasilkan produk-produk penemuan baru.
Bull, et al., (1982) menyatakan bahwa: Istilah bioteknologi
mempunyai pengertian sebagai penerapan teknik-teknik biologi,
biokimia dan rekayasa dalam pengolahan bahan dengan
memanfaatkan agensia jasad hidup dankomponan- komponen
untuk menghasilkan barang dan jasa.
Aplikasi bioteknologi sesungguhnya telah berlangsung cukup
lama, dalam peradapan manusia seperti upaya produksi antibiotik,
fermentasi, alkohol, pangan dan teknologi pengolahan limbah yang
semuanya dapat dikelompokan ke dalam biteknologi konvensional.
Tetapi mengapa nampaknya biteknologi baru saja berkembang pada
kurun abad ke dua puluh ini? Karena secara implisit yang dimaksud
bioteknologi adalah biteknologi modern, yang intinya adalah
rekayasa genetik, dengan teknik gen kloning yang berkembang
berdasar penemuan struktur dan fungsi DNA oleh Watson dan
Creck.
Dalam perkembangannya bioteknologi telah mencapai tingkat
rekayasa yang lebih terarah sehingga hasilnya dapat dikendalikan.
Dengan teknik yang dikenal sebagai teknik DNA rekombinan,
atau secara popular dikenal sebagai rekayasa genetika. Para
ilmuan dapat menyambung molekul-molekul DNA yang berbeda
menjadi suatu molekul DNA rekombinan yang inti prosesnya adalah
“kloning gena”.
C. Cabang Keilmuan Bioteknologi
Para ahli menerjemahkan fenomena-fenomena alam dengan
berbagai metode ilmiah dan dirangkum menjadi suatu ilmu. Ilmu
selanjutnya dikembangkan dan diaplikasikan dalam kehidupan sehari-
hari dengan bentuk teknologi. Beberapa ilmu dan teknologi yang
mendukung bioteknologi adalah sebagai berikut.
1. Mikrobiologi
Mikrobiologi merupakan cabang biologi yang mempelajari
tentang mikroba atau jasad renik. Pengetahuan tentang sifat-sifat
dan struktur mikroba mendukung kemajuan bioteknologi. Misalnya,
mikroba berupa bakteri dapat tumbuh pada kisaran suhu tertentu.
Pengetahuan mengenai bakteri ini dapat digunakan untuk membuat
yoghurt, yang memiliki bakteri Lactobacillus bulgaricus pada
kisaran suhu tertentu.
2. Biologi Sel
Biologi sel merupakan cabang biologi yang mempelajari
tentang sifat-sifat dan struktur sel. Pengetahuan mengenai sifat
protoplasma suatu sel yang dapat berfusi atau bergabung dengan
protoplasma sel lain pada spesies yang sama maupun berbeda,
bermanfaat bagi aplikasi fusi sel untuk meningkatkan keragaman
hayati. Fusi sel tersebut dapat dilakukan pada sel tanaman kedelai
dengan jagung serta sel tanaman kedelai dengan kacang kapri.
Contoh lainnya, pengetahuan mengenai sifat totipotensi pada
sel-sel tanaman bermanfaat untuk kultur jaringan. Totipotensi
merupakan kemampuan sel-sel tanaman untuk berdiferensiasi dan
tumbuh menjadi berbagai organ dan membentuk tanaman yang baru.
3. Genetika
Genetika merupakan cabang biologi yang mempelajari
pewarisan sifat-sifat genetik makhluk hidup dari suatu generasi ke
generasi berikutnya. Pemahaman mengenai bentuk dan karakteristik
materi pewaris sifat, yaitu DNA (gen) akan membantu percepatan
kemajuan bioteknologi. Tanaman transgenik tomat yang tahan
disimpan lama, insulin manusia yang disintesis dari bakteri
7
Escherichia coli dan lainnya merupakan penerapan ilmu genetika
dalam bioteknologi.
4. Biokimia
Biokimia merupakan cabang ilmu kimia yang mempelajari
makhluk hidup dari aspek kimianya. Biokimia menganggap hidup
adalah kimia, gejala hidup adalah gejala kimia dan proses-proses
hidup diselenggarakan atas dasar reaksi dan peristiwa kimia. Dengan
biokimia maka ahli bioteknologi memperlakukan makhluk hidup
sebagai bahan kimia yang dapat dipadukan dan direkayasa.
5. Imunologi
Imunologi mempelajari semua aspek sistem imun
(kekebalan tubuh) dalam merespons atau melawan mikroorganisme
atau unsur asing penyebab penyakit (seperti virus, bakteri, dan racun
dari bakteri), termasuk struktur dan fungsi sistem imun, kegagalan
pada sistem imun, imunisasi, dan transplantasi organ tubuh.
Semenjak Edward Jenner memperkenalkan vaksin dalam
mencegah penyakit cacar di tahun 1796, pemahaman kita
tentang imunologi berkembang pesat, antara lain tentang peranan
mikroba dalam menimbulkan penyakit, interaksi sel pembentuk
antibodi dan antigen, serta implikasi dari sistem imun mulai
disadari. Antigen, seperti bakteri berikut racunnya, memicu
pembentukan antibodi dalam darah setelah adanya serangan
penyakit infeksi. Riset terhadap AIDS sangat intensif dilakukan
untuk mengetahui mekanisme defisiensi sistem imun, serta penyakit-
penyakit yang timbul karena autoimun, seperti rheumatoid, arthritis,
lupus erythematosis, yang terjadi karena reaksi pertahanan tubuh
yang berlebihan terhadap komponen miliknya sendiri.
6. Teknologi Bioinformatika dan Biologi Komputasi
Teknologi bioinformatika mengembangkan algoritma, teknik
komputasi dan statistika untuk mengelola dan menganalisis data
biologi dalam menghasilkan sebuah informasi, sedangkan biologi
komputasi melakukan simulasi data biologi berdasarkan asumsi-
asumsi dalam mengembangkan pengetahuan biologi untuk
menghasilkan sebuah hipotesis.
8
7. Teknologi Antibodi Monoklonal
Teknologi antibodi monoklonal memiliki sel-sel sistem
imunitas yang membuat protein yang disebut antibodi. Sistem
kekebalan kita tersusun dari sejumlah tipe sel yang bekerja sama
untuk melokalisir dan menghancurkan substansi yang dapat
memasuki tubuh kita. Tiap tipe sel mempunyai tugas khusus.
Beberapa dari sel tersebut dapat membedakan komponen dari sel
tubuh sendiri (self) dan sel-sel asing (nonself). Salah satu dari sel-sel
yang cerdik ini adalah sel limfosit B yang mampu menanggapi
masuknya substansi asing dengan cara menghasilkan antibodi.
Antibodi akhirnya akan mengikat substansi asing dengan keakuratan
yang luar biasa.
8. Teknologi Sel dan Kultur Jaringan
Teknologi sel dan kultur jaringan adalah teknologi yang
memungkinkan kita menumbuhkan sel atau jaringan dalam nutrien
yang sesuai di laboratorium.
4
D. Jenis Jenis Bioteknologi
1. Bioteknologi konvensional
Bioteknologi konvensional sangat terbatas pada peran
mikroorganisme dengan teknik fermentasi dalam skala kecil dan
pembuatannya masih memiliki teknik sederhana. Prinsip dasar
bioteknologi konvensional adalah memanfaatkan mikroorganisme
utuh secara langsung tanpa proses rekayasa sehingga pemanfaatannya
masih sangat terbatas. Bioeknologi konvensional yang sering kita
dengar di kehidupan sehari hari adalah teknik fermentasi seperti
pembuatan tempe, tape dan yogurt.
2. Bioteknologi modern
Bioteknologi modern kita kenal dengan melibatkan rekayasa
genetika sehingga menghasilkan DNA rekombinan dan organisme
transgenik yang dapat di manfaatkan untuk menghasilkan produk
4
Tajuddin, Teuku, (2011). Pengantar bioteknologi. Universitas terbuka.
Jurnal bioteknologi.
9
yang di inginkan. Pada prinsipnya, bioteknologi modern merupakan
pemanfaatan bagian dari mikroorganime dengan melibatkan
teknologi modern.
Metode-metode mutakhir bioteknologi (current methods of
biotecnology) seperti:
1. Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk
memperbanyak jaringan/sel yang berasal atau yang didapat
dari jaringan orisinal tumbuhan atau hewan setelah terlebih
dahulu mengalami pemisahan (disagregasi) secara mekanis,
atau kimiawi (enzimatis) secara in vitro (dalam tabung kaca).
2. Teknologi DNA rekombinan (recombinan DNA technology)
adalah suatu metode untuk merekayasa genetik dengan
cara menyisipkan (insert) gena yang dikehendaki ke dalam
suatu organisme. Transgenik adalah suatu metode untuk
Rekayasa protein (protein engineering).
3. Hibridoma adalah suatu metode untuk menggabungkan
dua macam sel eukariot dengan tujuan mendapatkan sel
hibrid yang memiliki kemampuan kedua sel induknya.
4. Kloning adalah suatu metode untuk menghasilkan
keturunan yang dikehendaki sama persis dengan induknya.
5. Polymerase chains reaction (PCR) merupakan metode
yang sangat sensitif untuk mendeteksi dan menganalisis
sekuen asam nukleat.
5
E. Bioteknologi Konvensional
1. Teknik Fermentasi
Fermentasi adalahh suatu proses perubahan enzimatik secara
anaerob yang berasal dari senyawa organik kompleks menjadi
produk organik yang lebih sederhana. Proses fermentasi memiliki
mikroorganisme yang bersifat tidak patogen sehingga aman begi
5
Nurcahyo, Heru, (2011). Diktat Bioteknologi. Universitas Negeri
Yogyakarta. Yogyakarta.
10
kesehatan tubuh. Proses ini dapat menghasilkan alkohol, asam dan
gas. Salah satu tujuan utama fermentasi adalah untuk mengawetkan
makanan. Adanya perubhan karbohidrat menjadi asam organik dapat
membuat makanan menjadi tahan lama.
Keberhasialn proses fermentasi sangat bergantung pada kondisi
lingkungan. Hal in terjadi karena mikroorganisme yang digunakan
membutuhkan kesesuaian lingkungan agar dapat tumbuh dengan baik.
Ketidak sesuiain kondisi lingkungan saat proses inkubasi dapat
menyebbakan fermentasi tidak berjalan atau prosuk yang di hasilkan
bersifat toksik.
Dengan demikian proses fermentasi merupakan proses perubahan
senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan
menggunakn mikroorganisme. Karena manfaatnya yang cukup banyak
maka proses ini biasa digunakan oleh manusia sebagai bioteknologi
konvensioanal untuk meningkatkan potensi sumber makanan.
Sebagai suatu proses fermentasi memerlukan:
1. Mikroba sebagai inokulum (starter).
2. Tempat (wadah) untuk menjamin proses fermentasi
berlangsung dengan optimal.
3. Substrat sebagai tempat tumbuh (medium) dan sumber
nutrisi bagi mikroba.
4. Produk sebagai sesuatu yang dihasilkan dari proses
fermentasi.
Bioteknologi fermentasi menyangkut hal-hal yang berkaitan
dengan proses fermentasi yang meliputi:
1. Sifat Fermentasi
2. Prinsip Kultivasi Mikroba dalam Sistem Cair
3. Desain Bioreaktor (fermenter)
4. Desain Media
5. Instrumentasi dan Pengendalian Proses dalam Bioreaktor
6. Tenik Pengukuran
7. Pemindahan Massa dan Energi
11
8. Peningkatan Skala
9. Fermentasi pada subtrat
2. Prinsip-prinsip Fermentasi
Hal-hal yang perlu diperhatikan agar fermentasi dapat berjalan
dengan optimal maka harus memperhatikan faktor-faktor berikut ini:
1. Aseptis artinya terbebas dari kontaminan
2. Volume kultur relatif konstan (tidak bocor atau menguap)
3. Kadar oksigen terlarut harus memenuhi standar
4. Kondisi lingkungan seperti suhu, pH harus terkontrol
5. Komposisi medium pertumbuhan harus mencukupi
kebutuhan mikroba
6. Penyiapan inokulum harus murni
3. Sifat fermentasi
Sifat sifat fermentasi antara lain:
1. Fermentasi aerob
Memerlukan oksigen untuk mengubah subtrat gula menjadi
asam piruvat dan karbondioksida (CO2).
2. Fermentasi anaerob
Tidak memerlukan oksigen jadi gula akan di ubah menjadi
asam piruvat kemudian asetal dehida dan akhirnya menjadi
alkohol, etanol atau metanol dan asam laktat.
4. Prinsip kultivasi mikroba dalam sistem cair
Mikroba berada dalam cairan yang mengandung nutrien
sebagai substrat untuk tumbuh dan berkembang bercampur dengan
produk-produk yang dihasilkan termasuk limbah. Nutrien dan
oksigen yang diperlukan untuk pertumbuhan optimal mikroba harus
tercampur merata (homogen) pada semua bagian fermenter.
12
Sistem Fermenter Terbuka dan Tertutup
1. Tertutup, Semua nutrien ditambahkan pada awal fermentasi
dan pada akhir fermenetasi dikeluarkan bersama produknya.
Sebagai contoh: pembuatan bir (brewing), antibiotik, dan
enzim.
2. Terbuka (kontinu), Jika seluruh komponen system seperti
mikrorganisme dan nutrien secara terus menerus terjadi
pemasukan medium kultur dan pengeluaran biomas bersama
produk-produk fermentasi lainnya. Sebagai contoh: SCP
(petrokimia).
Tipe fermenter
Desain fermenter mulai dari yang sederhana (tangki dengan
putaran) sampai yang integrated system dengan komputer.
Fermenter berdasarkan system tipe opreasinya dapat dibedakan
menjadi 2 jenis yaitu:
1. Septis untuk pembuatan pengembang roti, bir (brewing).
2. Aseptis untuk memproduksi fine porduct seperti: antibiotik,
asam amino, polisakarida dan single cell protein (SCP).
Skala fermenter
Fermenter berdasarkan skala produksinya dapat dibedakan
menjadi 2 jenis yaitu:
1. Skala kecil (small scale) untuk industri rumah tangga (home
industry).
2. Skala besar (large scale) untuk industri skala besar
(petrokimia industry).
5. Desain Bioreaktor
Istilah fermenter (bioreaktor) digunakan untuk tempat
berlangsungnya proses fermentasi. Pada prinsipnya fermenter harus
menjamin pertumbuhan mikroba dan produk dari mikroba di
13
dalam fermenter. Semua bagian di dalam fermenter pada kondisi
yang sama dan semua nutrien termasuk oksigen harus tersedia merata
pada setiap bagian dalam fermenter dan produk limbah seperti; panas,
CO2 dan metabolit harus dapat dikeluarkan (remove). Fermenter
sebagai wadah harus dapat memberikan kondisi lingkungan fisik yang
cocok bagi katalis sehingga dapat berinteraksi secara optimal dengan
substrat. Oleh karena itu, wadah perlu didesain sedemikian rupa
sehingga proses dalam wadah dapat dimonitor dan dikontrol.
Bioreaktor adalah suatu tangki yang di dalamnya terjadi
proses kimia yang melibatkan mikroorganisme atau zat-zat biokimia
yang dihasilkan oleh mikroorganisme.
Proses aktivitas organisme dalam bioreaktor sangat dipengaruhi oleh
kondisi- kondisi: pH, suhu dan lain-lain, oleh karena itu pada
bioreaktor dilengkapi oleh Kontrol Aliran Gas (seperti O2, N2,
CO2), suhu, pH, Kadar oksigen terlarut, kecepatan putar pengaduk.
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi produksi dari
lingkungan luarnya bioreaktor dan semua pipa pendukung harus
disterilkan (biasanya dengan uap yang bertekanan tinggi). Sterilisasi
berarti hilangnya barbagai macam bentuk organisme yang dapat
tumbuh baik organisme yang menguntungkan maupun yang
merugikan dan organisme yang dapat merusak maupun mematikan
kultur murni yang dilakukan. Organisme ini dapat berbentuk seperti
bakteri, virus, fungi, spora dan mikroorganisme yang lainnya.
Untuk mencegah masuknya kontaminan melalui udara ke dalam
sistem, udara yang masuk harus terlebih dahulu dilewatkan melalui
glass wool yang steril.
Pada skala laboratorium atau industri skala kecil (small
scale), pemerataan medium dalam fermenter dapat dilakukan cukup
dengan mengocok atau memakai shaker. Pada skala besar (large
scale) dengan volume 2.000 liter, maka perlu desain fermenter
khusus yang menjamin medium dapat tercampur homogen. Masalah
utama fermenter untuk produksi skala besar adalah pemerataan
medium kultur dalam fermenter. Harus homogen artinya medium
kultur harus tercampur merata.Untuk mendapatkan sistem fermentasi
yang optimum, maka fermenter harus memenuhi syarat sebagai
berikut:
1. Terbebas dari kontaminan
2. Volume kultur relatif konstan (tidak bocor atau menguap)
3. Kadar oksigen terlarut harus memenuhi standar
4. Kondisi lingkungan seperti: suhu, pH harus terkontrol.
Stirred tank reactor system model yang banyak dipakai.
Masalah utama fermenter untuk produksi skala besar adalah
pemerataan medium kultur dalam fermenter. Harus homogen artinya
medium kultur harus tercampur merata. Oleh karena itu, wadah perlu
didesain sedemikian rupa sehingga proses dalam wadah dapat
dimonitor dan dikontrol. Fermenter memberikan kondisi lingkungan
fisik yang cocok bagi katalis sehingga dapat berinteraksi secara
optimal dengan substrat. Desain fermenter mulai dari yang sederhana
(tangki dengan putaran) sampai yang integrated system dengan
komputer.
6. Desain Media
Medium sebagai tempat tumbuh dan berkembang harus
menjamin ketersediaan dan kebutuhan mikroba untuk hidup dan
tumbuh berkembang. Medium biasa disebut substrat. Medium harus
mengandung nutrien dan oksigen yang dibutuhkan mikroba. Mikroba
berada dalam medium yang mengandung nutrien sebagai substrat
untuk tumbuh dan berkembang bercampur dengan produk-
produk yang dihasilkan termasuk limbah.
15
7. Inokulum
Inokulum adalah agen hayati meliputi organisme dan
komponen sub selulernya. Mikroba memiliki sifat khas sehingga
dapat digunakan sebagai agen untuk memproduksi bahan-bahan
kimia yang diperlukan oleh manusia. Mikroba memiliki kemampuan
mensintesis berbagai senyawa di alam dan juga dapat menghasilkan
berbagai jenis enzim yang dapat dimanfaatkan dalam industri
pengolahan makanan, bahan kimia, dan bahan farmasi. Enzim yang
dihasilkan merupakan katalisator yang mendorong terjadinya
proses sintesis dan perombakan bahan baku.
Jenis Inokulum Subtrat Produk
Jamur Rhizopus
oligoporus
Kedele
Ampas
kacang
Kedele
Ampas
kacang
Khamir Saccharomyces
cerevisiae
Bahan roti,
tetes tebu
Roti
Saccharomyces
cerevisiae
Bahan dasar
karbohidrat:
beras,
ketan,
ketela
Tape
Saccharomyces
cerevisiae
Air anggur,
bir, brem
Anggur,
Bir,
Brem
Bakteri Acetobacter
xylinum
Air Kelapa Nata de
coco
Streptococcus
thermophillus
Lactobacillus
bulgaricus
Air Susu Yogurt
16
8. Produk-produk Aplikasi Industri Bioteknologi Fermentasi
Dalam dimensi baru teknologi fermentasi mikroba berperan
untuk menghasilkan:
1. Bir
Sari buah atau gula diiberi Saccharomyces cerevisiae
kemudian diinkubasikan akan didapatkan minuman
beralkohol.
2. Yoghurt
Diproduksi dengan cara memfermentasi air susu dengan
bakteri bukan khamir. Biasanya memiliki campuran
Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus.
Pada pembuatan yoghurt air susu dipasteurisasi pada
suhu 73
o
C selama 15 detik. Kemudian ditambahkan kultur
starter bakteri. Fermentasi pada suhu 40
o
C selama 2,5-3,5
jam sampai susu menggumpal, dan asam laktat dihasilkan.
Bakteri mengubah gula susu (laktosa) pada kondisi
anaerobic. Lactose diubah menjadi asam laktat yang
bersifat menggumpalkan casein (protein susu). Dihasilkan
krem yoghurt tebal dengan rasa sedikit asam. Yoghurt
sebaiknya disimpan pada suhu 4
o
C untuk mengurangi
aktivitas mikroba.
3. Keju
Berbagai jenis bakteri dapat digunakan untuk
memfermentasi susu menjadi keju tergantung jenis keju
yang dihasilkan. Biasanya digunakan spesies Streptococcus
thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus. Enzim yang
diperlukan untuk menghasilkan keju adalah rennet yang
mengandung chymosin yang bersifat menggumpalkan
casein.
4. VCO
Santan kelapa bagian kanil (lapisan atas) diberikan
inokulum dieramkan beberapa hari kemudian didapatan
17
minyak kelapa murni (VCO) yang memiliki khasiat sebagai
obat.
5. Nata de coco (air kelapa), Nata de pina (nanas), nata de
soya (limbah tahu) . Acetobater xylinum ditumbuhkan pada
substrat gual yang diberi air kelapa dieramkan beberapa hari
didapatkan nata de coco.
6
F. Bioteknologi Modern
1. Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak
manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi
kehidupam manusia sehari- hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin,
bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan
memanfaatkan teknologi DNA Rekombinan.
Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak
langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil
penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah
digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada
manusia diobati dengan insulin manusia. Contoh lainnya adalah kapas
transgenik. Kapas transgenik pernah ramai dibicarakan di media masa
kita pada awal abad 21 ini. Salah satu kapas transgenik adalah kapas-
bt. Tanaman kapas-bt telah mengandung gen penyandi toksin yang
berasal dari bakteri Bacillus turingiensis (Bt). Toksin tersebut dapat
membunuh hama kapas sehingga kapas-bt tersebut tahan terhadap
serangan hama. Tanaman kapas ini tahan terhadap serangan hama
(ulat) karena tanaman ini menghasilkan toksin yang dapat membunuh
hamanya (ulat). Toksin tersebut disandikan oleh gen yang berasal dari
bakteri Bacillus turingiensis
Genom tanaman kapas ini mengandung gen yang berasal dari
bakteri Bacillus turingiensis. Oleh karena itu, tanaman kapas ini
seringkali disebut sebagai kapas-Bt (Bt =Bacillus turingiensis). Kapas-
6
Dosen Pendidikan Biologi, (2015). Materi penataran Guru guru
MGMP Bidang Biologi. FMIPA Universutas Negeri Yogyakarta.
18
bt merupakan salah satu contoh organisme transgenik. Organisme
transgenik adalah organisme yang mengandung gen yang berasal dari
jenis organisme lainnya. Oleh karena tanaman kapas ini mengandung
gen yang asalnya dari organisme lainnya, maka kapas ini secara
umum disebut tanaman kapas transgenik.
Bakteri penghasil insulin dan tanaman kapas-bt tersebut merupakan
sebagian dari hasil rekayasa yang dilakukan manusia terhadap
makhluk hidup dengan memiliki teknologi DNA rekombinan.
Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk
menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu
dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan
bertujuan untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik
DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik memotong DNA,
teknik menggabung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke
dalam sel hidup. Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga
rekayasa genetika ini adalah suatu ilmu yang mempelajari
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara
penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan
dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya
melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing-masing gen dan
mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga
memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam
waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara
konvensional. Sejak jaman dahulu, nenek moyang kita telah
mengetahui adanya keanekaragaman makhluk hidup.
1) Dasar Teknologi DNA Rekombinan
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat
melalui tiga cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA
yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi
dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom
rekombinan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel
(sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resepien) melalui kontak
19
fisik antara kedua sel. Sel donor memasukkan sebagian DNA-nya ke
dalam sel resepien.
a. Konjugasi
Merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam
sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.
Sel donor (sel jantan) memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel
resipien (sel betina). Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki
oleh sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel
jantan berpindah ke dalam sel betina secara replikatif. Oleh karena itu,
setelah proses konjugasi selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA.
Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah kembali dan jumlah sel
tidak bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan anak sel). Oleh
karena itu, proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses atau
mekanisme seksual yang tidak reproduktif.
b. Transformasi
Merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di
sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat
berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel
bakteri lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari
lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami.
Fenomena transformasi ini telah diamati oleh Griffith (1928) dan
kelompok Avery (1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa
strain bakteri yang tidak virulen (strain yang penampilan koloninya
kasar) dapat berubah sifatnya menjadi strain yang virulen (penampilan
koloninya halus). Perubahan sifat ini disebabkan karena strain yang
tidak virulen (strain kasar) dicampur dengan sel-sel bakteri strain
virulen (strain halus) yang telah dimatikan.
c. Transduksi
Cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui
perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis virus berkembang biak di
dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri sering
disebut bakteriofag atau fage. Ketika virus menginfeksi bakteri, fage
memasukkan DNA-nya ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian
akan bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan
kromosom baketri. DNA fage yang dikemas ketika membentuk
20
partikel fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang
menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri
yang lain, maka fage akan memasukkan DNAnya yang sebagian
mengandung DNA sel inang sebelumnya. Jadi, secara alami fage
memindahkan DNA dari satu sle bakteri ke bakteri yang lain.
Gambar 2.2 Proses transduksi pada sel bakteri
2) Perangkat teknologi DNA rekombinan
Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan
diantaranya
a. Enzim restriksi
Digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960, Werner
Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat
memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan
nama enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut
mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang
panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut sekarang
dikenal dengan nama enzim restriksi atau enzim endonuklease
restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk
menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke
dalam sel bakteri). Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi
yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri.
Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang
menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Setiap
enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas.
21
Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi
memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai
aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens
pengenal.
b. Enzim DNA ligase
Digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun 1972, David
Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa mereka
berhasil membuat molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil
menggabungkan fragmen-fragmen DNA dengan cara memasangkan
(anneal) ujung sticky ends dari satu fragmen dengan ujung sticky ends
fragmen lainnya, kemudian menyambungkan kedua ujung fragmen-
fragmen tersebut secara kovalen dengan memiliki enzim DNA
ligase. Keberhasilan membuat DNA rekombinan ini terjadi tidak lama
setelah enzim restriksi ditemukan dan diisolasi pertama kali dari E.coli
oleh Herbert Boyer yaitu pada tahun 1969 .
c. Plasmid
Digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau
mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Pada
umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri
berupa DNA sirkular atau DNA yang berbentuk lingkaran. Disamping
memiliki satu kromosom, berbagai jenis bakteri juga memiliki DNA
sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil dari pada DNA
kromosomnya. DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat pada
bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plasmid merupakan DNA bakteri
yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi
sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah jenis,
dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar
sel dalam satu spesies bakteri.
d. Transposon
Digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk
menyisipkan penanda. Keberhasilan para ahli dalam melakukan
rekayasa genetika terhadap berbagai organisme tidak lepas dari
peranan transposon. Transposon atau elemen loncat mula-mula
ditemukan oleh Barbara McClintock. Untuk sampai pada penemuan
tentang adanya transposon, Barbara McClintock mempelajari
22
penyebab terjadinya variasi warna biji jagung. Seperti yang pernah
anda pelajari sebelumnya bahwa biji jagung terbentuk sebagai hasil
dari pembuahan ganda (dua pembuahan). Satu pembuahan
menghasilkan zigot yang kemudian berkembang menjadi embrio yang
tersimpan dalam biji jagung. Satu pembuahan lainnya menghasilkan
endosperma. Endosperma inilah yang kita lihat penampilannya (yang
nampak sebagai biji jagung). Endosperma ini merupakan bagian
terbesar dari biji dan merupakan bagian penyimpan makanan.
Endosperma inilah yang kita gunakan kandungan karbohidratnya
untuk makanan kita maupun makanan ternak.
Jadi, transposon adalah DNA yang dengan sendirinya dapat
berpindah-pindah tempat atau berpindah posisinya. Transposon dapat
berpindah-pindah tempatnya pada satu molekul DNA atau pada satu
krosom. Transposon juga dapat pindah dari satu molekul DNA ke
molekul DNA lainnya atau pindah dari satu kromosom ke kromosom
lainnya. Karena memiliki kemampuan untuk berpindah tempat dengan
sendirinya maka sering kali transposon disebut juga dengan nama
elemen loncat.
e. Enzim traskripsi balik
Digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA. Tidak lama
setelah penemuan enzim restriksi, Howard Temin dan David
Baltimore secara terpisah pada tahun 1970 menemukan enzim
transkripsi-balik (reverse-transcriptase) yang digunakan oleh
retrovirus untuk membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya. Enzim
transkripsi-balik ini kemudian digunakan untuk mengkonstruksi copy
DNA yang disebut cDNA (complementary DNA) dengan
memiliki RNA sebagai cetakannya. Dengan demikian gen atau
bagian dari gen dapat disintesis berdasarkan mRNA. Proses sintesis
DNA dengan cara ini merupakan kebalikan dari pada proses
transkripsi. Oleh karena itu dinamakan transkripsi balik.
Tahapan utama dalam pembuatan DNA memiliki transkriptase
balik ini adalah sebagai berikut:
1. DNA gen eukariot terdiri atas intron dan exon, pada wakttu
transkripsi semua bagian tersebut diterjemahkan oleh enzim
transkriptase menjadi RNA.
23
2. Enzim transkriptasi balik mensisntesis DNA dengan
memiliki mRNA tersebut sebagai cetakannya. Hasilnya
berupa DNA utas tunggal.
3. Pelacak DNA / RNA
Digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang
diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar.
7
3. Hibridoma
Teknologi yang digunakan untuk menghasilkan antibodi
monoklonal yang identik terhadap antigen spesifik dengan jumlah
yang besar. Teknologi ini di temukan pada tahun 1975 oleh george
kohler dan cesar milstein. Pembuatan antibodi di lakukan dengan cara
menggabungkan sel limfosit-B dengan sel kanker. Hal ini dilakukan
karena sel limfosit-B mampu menghasilkan antibodi namun memiliki
waktu hidup yang terbatas dalam kultur. Keterbatasan ini dapat diatasi
dengan cara penggabungan dengan sel kanker yang memliki sifat
dapat membelah dengan cepat. Dengan penggabungan tersebut, maka
sel limfosit-B dapat membelah dengan cepat sehingga dapat
dihasilkan antibody yang identik dalam kultur sel. Sehingga sel
hibridoma ini bersifat immortal.
Dengan demikian, teknologi hibridoma merupakan suatu
bioteknologi modern yang menggabungkan dua sel untuk
menghasilkan antibodi spesifik dengan jumlah besar.
4. Kultur Jaringan
Kultur jarinagn merupakan teknik perbanyakan tanaman sacara
vegetatif yang dilakukan dalam laboratorium secara in vitro yang di
dasarkan pada sifat totiponsi tumbuhan. Prinsip kultur jaringan adalah
menumbuhkan jarinagan maupun sel tumbuhan dalam suatu media
buatan secara antiseptik. Dalam teori tersebut dikatakn bahwa setiap
sel tumbuhan mempunyai kemampuan untuk tumbuh menjadi
7
Tjahjoeleksono, Aris, (2011). Teknologi DNA Rekombinan, Institut
Pertanian Bogor. Bogor.
24
individu baru apabila ditempatkan pada lingkungan yang sesuai. Sifat
individu baru yang dihasilkan sama persis dengan sifat induknya.
Bagian tumbuhan yang ditumbuhkan dalam media kultur disebut
eksplan. Eksplan yang sering digunakan merupakan bagian tumbuhan
yang memiliki sel sel yang aktif membelah seperti ujung akar dan
ujung batang. Potongan bagian tumbuhan yang ditanam pada media
kultur akan tumbuh membentuk kalus. Kalus merupakan massa sel
yang belum terdeferensiasi. Kalus tersebut akan berkembang menjadi
tanaman lengkap uyang disebut plantlet.
Media kultur jaringan yang digunakan biasanya agar agar yang
ditambah dengan unsur hara dan vitamin yang dibutuhkan oleh
tumbuhan media tersebut juga dapat ditambah dengan hormon
pertumbuhan, misalnya auksin dan sitokinin. Auksin akan memicu
pertumbuhan akar, sedangkan sitokinin akan memicu pertumbuhan
tunas. Komposisi kultur jaringan tergantung pada spesies tumbuhan
yang di perbanyak.
Dengan memiliki teknik kultur jaringan, individu tumbuahn
dapat diperbanyak dalam jumlah besar, yang setiap anaknya memiliki
sifat genetis yang identik. Teknik ini telah digunakan untuk
memperbanyak bibit unggul untuk pertanian.
Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik
kultur jaringan adalah
a. Pembuatan Media
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan
kultur jaringan. Media yang di gunakan biasanya terdiri dari garam
mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu di perlukan juga bahan
tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh
(hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun
jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang
dilakukan. Media tumbuh dapat dibedakan menjadi media padat dan
media cair. Media padat umumnya berupa padatan gel, seperti agar,
dimana nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang
dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi
selalu bergerak, tergantung kebutuhan.
25
b. Inisiasi
Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang
akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk
kegiatan kultur jaringan adalah tunas. Eksplan dapat berasal dari :
daun, tunas, cabang, batang, akar, embrio, kotiledon, hipokotil,
epikotil
c. Sterilisasi
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan
harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan
memiliki alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan
terhadap peralatan, yaitu memiliki etanol yang disemprotkan
secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang
melakukan kultur jaringan juga harus steril.
d. Multiplikasi
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman
dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di
laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang
menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang
telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di
tempat yang steril dengan suhu kamar.
e. Pengakaran
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukan adanya
pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang
dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap
hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk
melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang
terkontaminasi akan menunjukan gejala seperti berwarna putih atau
biru (disebabkan oleh jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
f. Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari
ruangan aseptik ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan
bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan
untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit
karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan
26
hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi
dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan
dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan
pemeliharaan bibit generatif.
8
5. Teknologi tanaman transgenik
Ahli rekayasa genetik tanaman melakukan transformasi gen
dengan tujuan untuk memindahkan gen yang mengatur sifat-
sifat yang diinginkan dari satu organisme ke organisme lainnya.
Beberapa sifat yang banyak dikembangkan untuk pembuatan
tanaman transgenik misalnya (1) gen resistensi terhadap hama,
penyakit dan herbisisda, (2) gen kandungan protein tinggi, (3) gen
resistensi terhadap stres lingkungan seperti kadar alumium tinggi
ataupun kekeringan dan (4) gen yang mengekspresikan suatu ciri
fenotipe yang sangat menarik seperti warna dan bentuk bunga,
bentuk daun dan pohon yang eksotik.
Dalam hubungannya dengan pembuatan tanaman transgenik
terdapat tiga komponen penting yaitu:
1. Isolasi gen target. Gen target yang kita inginkan misalnya
gen Bt (gen tahan terhadap penggerek yang diisolasi dari
bakteri Bacillus thuringensis) diekstrak kemudian dipotong
dengan enzim restriksi. Gen yang sudah terpotong-potong
kemudian diseleksi bagian gen mana yang menyandikan
gen Bt dan diisolasi. Potongan gen Bt kemudian disisipkan
ke dalam DNA sirkular (plasmid) sebagai vektor
menghasilkan molekul DNA rekombinan gen Bt. Vektor
yang sudah mengandung molekul DNA rekombinan gen
Bt dimasukkan kembali ke dalam sel inang yaitu bakteri
untuk diperbanyak. Sel inang akan membelah membentuk
progeni baru yang sudah merupakan sel DNA rekombinan
gen Bt.
8
Dwiyani rindang, Hestin, d.k.k, (2017). Modul Praktikum Teknologi
Kultur Jaringan. Universitas Udayana. Bali
27
2. Proses transfer gen ke tanaman target. Agar sel DNA
rekombinan get Bt dapat terintegrasi pada inti sel tanaman
maka diperlukan vektor yang lain lagi untuk memindahkan
gen Bt ke dalam inti sel tanaman. Vektor tersebut adalah
bakteri Agrobacterium tumefaciens. Bakteri ini
menyebabkan penyakit tumor pada tanaman. Penyakit ini
akan terjadi bila terdapat luka pada batang tanaman
sehingga memungkinkan bakteri menyerang tanaman
tersebut. Luka pada tanaman mengakibatkan tanaman
mengeluarkan senyawa opine yang merangsang bakteri untuk
menyerang tanaman dimana senyawa ini merupakan sumber
carbon dan nitrogen dari bakteri. Akibat masuknya bakteri
menyebabkan terjadinya proliferasi sel yang berlebihan
sehingga menimbulkan penyakit tumor pada tanaman.
Kemampuan untuk menyebabkan penyakit ini pada
tanaman ternyata ada hubungannya dengan DNA sirkular
(plasmid) Ti (Tumor inducing plasmid) dalam sel bakteri
A.tumefaciens. Sifat yang menyolok pada plasmid Ti
ialah bahwa setelah infeksi oleh A. tumefaciens, sebagian
dari molekul DNAnya berintegrasi dalam DNA kromosom
tanaman. Segmen ini dikenal dengan nama T-DNA
(transfer DNA). Metode kerjasama antara tanaman dan A.
tumefaciens ini digunakan oleh ahli rekayasa genetika
tanaman untuk memindahkan gen Bt agar dapat terintegrasi
dalam sel tanaman. Oleh karena itu langkah selanjutnya
adalah menyisipkan DNA rekombinan yang sudah
membawa gen Bt ke dalam plasmid Ti dari A. tumefaciens.
Setelah itu A. tumefaciens yang membawa gen Bt
diinokulasikan pada tanaman. Proses inokulasi tersebut
dilakukan pada tanaman target yang sedang diregenerasikan
dalam kultur jaringan. Hal ini memudahkan bagi proses
transfer gen Bt ke dalam inti jaringan tanaman dimana
tanaman masih dalam proses pembelahan sel yang sangat
aktif.
3. Ekspresi gen pada tanaman transgenik. Gen yang sudah
dimasukkan ke dalam tanaman target dalam hal ini adalah
28
gen Bt yang mengekspresikan tanaman transgenik tahan
terhadap hama penggerek harus dapat diexpresikan. Untuk
mengetahui apakah gen tersebut terekspresi atau tidak
digunakan penanda yaitu selectable and scoreable marker,
dimana apabila tanaman target dapat tumbuh pada media
yang mengandung antibiotika atau tanaman target
menampakan warna khusus (warna biru untuk penanda
gen gus) maka tanaman target itu adalah tanaman
transgenik.
Tanaman transgenic yang memiliki sifat tahan terhadap serangan
hama, atau tahan terhadap cekaman lingkungan garam dengan tujuan
untuk peningkatan produksi pangan.
9
6. Kloning Gen
Sejak ditemukannya enzim restriksi (enzim yang dapat memotong
DNA pada urutan yang spesifik) dan ditemukannya enzim ligase
(enzim yang dapat menyambungkan potongan DNA), maka DNA dari
organisme apa saja dapat diisolasi, dipotong-potong, disambungkan
kembali dan dipindahkan ke organisme lain. Proses
mengkombinasikan beberapa DNA dan memperbanyak DNA
rekombinan tersebut di dalam sel disebut kloning. Proses
memasukkan DNA ke dalam sel disebut transformasi dan sel yang
dihasilkan disebut transforman. Agar suatu DNA dapat diperbanyak di
dalam sel, maka DNA tersebut harus disisipkan ke dalam suatu
plasmid (berfungsi sebagai vektor/pembawa) yang dapat bereplikasi di
dalam sel. Kumpulan sel-sel yang mengandung plasmid rekombinan
yang sama disebut sebagai suatu klon.
Pada kloning gen: suatu fragmen DNA yang mengandung gen
yang akan di klon disisipkan pada molekul DNA vektor untuk
menghasilkan molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan ini
digunakan untuk mentransformasi sel inang (biasanya bakteri). Di
dalam sel, vektor mengadakan replikasi, menghasilkan banyak copy
9
Nurcahyo, Heru, (2011). Diktat Bioteknologi. Universitas Negeri
Yogyakarta. Yogyakarta.
29
atau turunan yang identik, baik vektornya maupun gen yang
dibawanya. Ketika sel inang membelah, copy molekul DNA
rekombinan diwariskan pada progeni. Setelah terjadi sejumlah besar
pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel inang yang
identik. Tiap-tiap klon mengandung satu copy atau lebih molekul
DNA rekombinan.
Gambar 2.3. Proses kloning
Kloning melibatkan lima komponen utama, yaitu : fragmen
DNA (gen) yang akan di kloning (disebut juga DNA sisipan), DNA
vektor (bisa plasmid, bakteriofaga atau cosmid), enzim restriksi,
enzim ligase dan sel inang (bakteri atau ragi).
1. DNA sisipan
Tujuan kloning adalah memperbanyak suatu fragmen DNA dari
suatu organisme dalam suatu sel inang. Namun tujuan akhirnya bisa
bermacam-macam, diantaranya: produksi protein penting dengan skala
besar, untuk deteksi patogen atau sel abnormal. DNA sisipan bisa
diperoleh dengan dua cara, yaitu :
a. Produk PCR.
Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi
b. DNA vektor
Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang
bertindak sebagai wadah untuk membawa DNA sisipan masuk
ke dalam sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya.
Berdasarkan fungsinya vektor dapat dibagi dua, yaitu : vektor
30
kloning dan vektor ekspresi. Vektor kloning hanya berfungsi
untuk memperbanyak fragmen DNA yang disisipkan,
sehingga fragmen DNA tersebut hanya direplikasi, tidak di
transkripsi. Biasanya vektor ini digunakan untuk tujuan
sekuensing atau untuk perbanyakan DNA yang nantinya akan
di sisipkan ke vektor ekspresi. Sementara vektor ekspresi
digunakan untuk memproduksi protein dari gen yang diklon.
2. Plasmid
Plasmid merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk
sirkular dan terdapat bebas di dalam sel. Plasmid dapat bereplikasi
sendiri di dalam sel inang karena mempunyai suatu urutan DNA
spesifik yang disebut ori (origin of replication/titik awal replikasi).
Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih yang
menyebabkan ciri- ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri inang,
misalnya plasmid yangmembawa gen resistan antibiotik
3. Vektor ekspresi
Vektor ekspresi merupakan vektor yang mana disamping
dapat bereplikasi sendiri juga mengandung sinyal-sinyal ekspresi,
sehingga gen yang di klon juga akan ditranskripsi menjadi mRNA dan
kemudian ditranslasi menjadi protein. Vektor ekspresi memungkinkan
untuk produksi protein hewan, manusia atau tanaman di dalam
bakteri. Tiga sinyal ekspresi yang paling penting adalah : (1)
Promotor transkripsi, (2) terminator transkripsi, dan (3) tempat
pengikatan ribosom. Selain sistem vektor ekspresi untuk bakteri, juga
terdapat beberapa sistem vektor ekspresi untuk Saccaromyces
cerevisiae dan vektor ekspresi untuk Pichia pastoris. Kedua jenis
sistem ekspresi ini terbukti dapat memproduksi protein eukariot
dengan hasil yang tinggi dan berfungsi seperti protein natif (asli).
Tahapan-tahapan kloning
Tahapan pengerjaan kloning DNA/gen adalah sebagai berikut :
1. Isolasi/ preparasi DNA
Sebelum disisipkan ke suatu DNA vektor, maka DNA sisipan
harus diisolasi terlebih dulu. Beberapa prinsip isolasi DNA sudah
31
dijelaskan di atas. Selain itu DNA sisipan juga dapat diperoleh dari
produk PCR.
2. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Molekul plasmid yang digunakan sebagai vektor harus
dipotong untuk membuka DNA lingkaran, sehingga molekul DNA
asing bisa disisipkan. Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease
yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNA dan memotong
pada urutan yang spesifik tersebut. Sisi pengenalan enzim restriksi
umumnya merupakan suatu polindrom, dimana urutan nukleotida
rantai atas sama dengan urutan nukleotida rantai bawah. Misalnya :
Enzim restriksi hanya terdapat pada beberapa bakteri, dan
berfungsi untuk mempertahankan diri dari infeksi bakteriofaga.
Contoh beberapa enzim restriksi dan sisi pengenalannya:
Nama enzim Sumber bakteri Urutan
pengenalan AluI Arthrobacter luteus AG↓CT
BamHI Bacillus G↓GATCC
ClaI Caryophanon latum AT↓GCAT
EcoRI Escherichia coli G↓AATTC
HaeIII Haemophilus
aegyptius
GG↓CC
HindIII Haemophylus
influenza
A↓AGCTT
KpnI Klebsiella
pneumonia
GGTAC↓C
NotI Nocardia otidis-
caviarum
GC↓GGCCGC
PstI Providencia stuartii CTGCA↓G
32
XbaI Xanthomonas bradii T↓CTAGA
XhoI Xanthomonas
holcicola
C↓TCGAG
Tabel 3.1. Beberapa enz m restriksi dan urutan pengenalnya
3. Penyambungan DNA dengan enzim ligase
Apabila dua molekul DNA mempunyai ujung rantai
tunggal yang komplementer, maka kedua ujung DNA tersebut dapat
berpansangan, kemudian enzim ligase dapat membentuk ikatan
fosfodiester antara kedua molekul DNA tersebut. Reaksi enzimatik ini
memerlukan energi dari ATP.
4. Transformasi sel
Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel tersebut
harus diberi perlakukan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang
mampu menerima DNA dari luar. Kemampuan paling tinggi untuk
memasukkan DNA dari luar terjadi pada sel yang berada dalam fase
logaritmik, yaitu pada waktu pertumbuhan sel sedang cepat.
Perlakukan dengan CaCl2 menyebabkan dinding sel menjadi lebih
permeabel dan bermuatan positif, sehingga dapat menarik DNA yang
bermuatan negatif Transformasi (pengambilan DNA oleh sel bakteri)
dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu : (1) dengan cara heat shock
(kejutan panas) dimana campuran sel dan DNA plasmid rekombinan
didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskan
dengan segera pada suhu 42
o
C. (2) dengan cara elektroporasi (kejutan
listrik) memiliki suatu alat yang dialiri arus listrik.
33
5. Seleksi klon rekombinan
Sel inang yang telah ditansformasi kemudian ditumbuhkan
pada media padat yang sesuai pada suhu 37
o
C. Setelah inkubasi
semalam, maka kita akan mendapatkan koloni-koloni bakteri yang
tumbuh di media padat. Satu koloni bakteri terdiri dari jutaan sel
bakteri yang mempunyai sifat yang sama. Sehingga klon-klon ini
perlu dipilih untuk menentukan mana koloni bakteri yang membawa
plasmid rekombinan.
6. Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid rekombinan, kemudian dapat diisolasi untuk
kepentingan pengerjaan berkutnya dengan memiliki metoda yang
sudah dijelaskan di atas. DNA ini selanjutnya dapat di karakterisasi,
misalnya disekuensing untuk menentukan urutan nukleotidanya atau
dapat juga di potong dengan enzim restriksi kemudian di kloning ke
vektor ekspresi.
10
7. PCR (Polimerase Chain Reaction)
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik
perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer
yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah
DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA
templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara
in vivo yang bersifat semi konservatif.
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua
primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke
dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda
yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-
target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA
baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan
sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer
10
Tjahjoeleksono, Aris, (2011). Teknologi DNA Rekombinan, Institut
Pertanian Bogor. Bogor.
34
akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya
yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga
kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada
karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA
polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan
menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida
templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat
dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang
dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah
5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase
hanya akan menambahkan dNTP yangkomplemen dengan nukleotida
yang terdapat pada rantai DNA templat.
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga
tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat,
penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan
pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang
dikaalisis oleh DNA polimerase.
1. Tahapan PCR
a. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka
menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi
yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-
basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak
berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang
sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90
o
C – 95
o
C.
b. Penempelan primer
Tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju
daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada
proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer
dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya
35
dilakukan pada suhu 50
o
C – 60
o
C. Selanjutnya, DNA polymerase
akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat
kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi
polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72
o
C.
c. Reaksi polimerisasi (extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini,
terjadi pada suhu 72
o
C. Primer yang telah menempel tadi akan
mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP
yang komplemen dengan templat oleh DNA polymerase.
Gambar 2.4. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi, penempelan
primer (annealing) dan polimerisasinya
2. Komponen PCR
1. Enzim DNA
Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan memiliki
Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya.
Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses
denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap
siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk
perpanjangan 200bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk
mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian
dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada
suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan
di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin
36
2. Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal
yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan
diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk
merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada
awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis
memiliki suatu alat yang disebut DNA synthesizer.
3. Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang
ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut
adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang
mengandung MgCl2. Konsentrasi ion Mg
2+
dalam campuran
reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg
2+
ini
sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi,
spesifisitas produk.
11
8. Beberapa Produk Pemanfaatan Rekayasa Genetika
1. Produksi Obat Sel Mammalia
Mikroorganisme transgenik yang memiliki sifat dapat
memproduksi: obat-obatan terhadap penyakit infeksi (antibiotik)
seperti penisilin, streptomysin. hormon, sebagai contoh insulin untuk
terapi penderita kencing manis.
2. Produksi Vaksin Rekombinan
Vaksin rekombinan yang berguna untuk pencegahan jenis
penyakit tertentu sekaligus karena mengandung beberapa
protein antigen sehingga dapat melindungi dari serangan
berbagai penyakit menular. Masalah untuk memproduksi virus
(parasit obligat intraseluler) memerlukan sel hidup, jika
memiliki sel hewan memerlukan banyak hewan. Solusi,
memiliki kultur jaringan hewan lebih efisien. Berbagai problem
37
dengan porduksi vaksin secara konvensional di atas, terutama
masalah keamanan, digunakan teknologi rekombinan untuk
memproduksi vaksin yang lebih aman dan potensial. Subunit virus
diproduksi oleh bakteri atau yeast (kapang). Salah satu pemanfaatan
kultur sel secara komersial pertama kali sebagai media untuk
memproduksi virus. Virus merupakan mikroorganisme yang bersifat
sebagai parasit obligat intraseluler.
Vaksin viral dapat dibedakan menjadi 2 tipe yaitu:
a. Vaksin hidup (life vaccine) dari virus hidup yang kurang
poten terhadap manusia.
b. Vaksin mati (killed vaccine) dari agen yang telah dimatikan.
Biasa digunakan kultur sel dari embrio ayam (chicken
embryo) untuk memproduksi vaksin influenza dan
yellow fever.
Keuntungan teknologi rekombinan DNA dapat dihasilkan vaksin
yang melawan virus yang tidak dapat tumbuh pada medium kultur
terhadap titer tinggi untuk memberi antigen yang cukup untuk
keberhasilan vaksinasi. Sekali vaksinasi dapat memberikan beberapa
kekebalan sekaligus terhadap berbagai jenis virus dengan cara
menyisipkan gena berbagai imunogen pada plasmid bakteri.
Sebagai contoh: penyakit tetelo, Marek’s, cacar ayam. Berbagai
problem dengan porduksi vaksin secara konvensioanl di atas,
terutama masalah keamanan, digunakan teknologi rekombinan
untuk memproduksi vaksin yang lebih aman dan potensial. Subunit
virus diproduksi oleh bakteri atau yeast (kapang). Keuntungan
teknologi rekombinan DNA dapat dihasilkan vaksin yang melawan
virus yang tidak dapat tumbuh pada medium kultur terhadap titer
tinggi untuk memberi antigen yang cukup untuk keberhasilan
vaksinasi. Sekali vaksinasi dapat memberikan beberapa kekebalan
sekaligus terhadap berbagai jenis virus dengan cara menyisipkan gena
berbagai imunogen pada plasmid bakteri. Sebagai contoh:
penyakit tetelo, Marek’s, cacar ayam. Produksi zat kebal (antibodi)
monoklonal untuk terapi, penelitian, dan diagnosis penyakit.
38
No Jenis Virus Sel yang digunakan
Kultur 1 Cacar air Fibroblas embrio ayam
2 Polio (inaktif) Sel ginjal monyet
3 Polio (aktif/hidup) Sel diploid manusia,
ginjal kera 4 Rabies Sel diploid manusia
3. Terapi Gena
Terapi gena bertujuan untuk membetulkan kelainan metabolisme
karena bawaan sejak lahir dengan cara menyisipkan gene normal ke
organisme penderita. Terapi gene sel somatik dari sudut pandang
sosial masih menimbulkan masalah pro dan kontra. Masih
dipertimbangkan dengan alasan karena resiko dan keamanan.
Untuk terapi gena dengan tujuan untuk mereparasi gena karena cacat
bawaan yang menyebabkan perubahan genotipe keturunannya.
Sel diekstrasi dikeluarkan dari tubuh kemudian ditumbuhkan
dalam medium kultur selanjutnya genenya dimanipulasi
dikembalikan ke pasien (penderita) yang jaringannya diambil.
Permasalahan pada penderita kelainan genetik yang dibawa sejak
dalam kandungan belum ada terapi sehingga perlu terapi gene.
