eduksi komplikasi vaskuler
secara persisten terjadi pada kelompok kontrol
intensif pada awal pengobatan dibandingkan dengan
terapi konvensional. Studi Veteral Affairs Diabetes
Trial selama follow-up 10 tahun menunjukkan
manfaat klinis pada kelompok dengan pengontrolan
glukosa intensif, meskipun tidak diperoleh
perbedaan outcome kardiovaskuler pada awal
pengobatan. Konsistensi hasil akhir studi ini dengan
studi lain menunjukkan bahwa outcome
kardiovaskuler tetap negatif meskipun telah
dilakukan uji coba beberapa obat hipoglikemik yang
baru. Hal ini menunjukkan adanya pengaruh
hiperglikemia terdahulu sebagai faktor patogenik
yang mendasarinya yang disebabkan oleh
mekanisme pada tingkat molekuler yaitu perubahan
ekspresi gen pada vaskulopati akibat pemaparan
glukosa sebelumnya. Adanya memori biologik
terhadap hiperglikemia inilah sebagai pemicu
terhadap outcome penyakit vaskuler diabetik.
Pemicu ekspresi gen ini yaitu perubahan epigenetik
sebagai penyebab memori biologik yang mendasari
komplikasi kardiometabolik. 18
Unit kromatin dengan nukleosom oktamerik
tersusun yaitu 2 copy pada masing-masing protein
histon H2A, H2B, H3 dan H4 mengelilingi 147 bp
DNA (Gambar 9).19 Kemampuan kromatin
mengalami perubahan adaptasi struktur dan
remodeling dari transisi tertutup (heterokromatin)
menjadi terbuka (eukromatin) terhadap sel yaitu
kemampuan mengelola respon terhadap berbagai
stimuli dengan mengatur asesibilitas sehingga terjadi
perubahan ekspresi gen. 21
Bersama dengan aktivitas microRNA dan long
noncoding RNA, komponen kromatin marks
menentukan regio struktur dan fungsi genom.22
Modifikasi epigenetik melibatkan kromatin marks
berupa writer, eraser dan reader. Writer
membutuhkan enzim khusus yang memodifikasi
pada ekor histon, sedangkan eraser mengeluarkan
marks. Akhirnya, kelompok protein ketiga yaitu
reader yang mengenal histone marks dan
memungkinkan ekspresi gen berlangsung.
Gambar 9. Kromatin dan residu modifikasi. Kromatin mengatur struktur dan fungsi gen. DNA dibungkus menjadi satu
makrostruktur 30 nm terdiri dari serabut kromatin. Bersama dengan residu posttranlation modifications (PTM), kromatin
mengatur fungsi meliputi transkripsi, repair, replikasi dan kondensasi. Nukleosom sebesar 11 nm terdiri dari 147 bp
DNA dengan satu oktamer tersusun atas 2 copy dari masing-masing protein histon H2A, H2B, H3 dan H4. Ekor histon
dapat mengalami perubahan oleh writing enzyme dengan menambahkan histone methyltransferase, Set7. Ekor histon juga
cenderung terhadap perubahan oleh erasing enzyme yang mengeluarkan modifikasi dan diintepretasi oleh protein reader
yang mengidentifikasi modifikasi ekor histon. Residu cytosine dari dupleks DNA cenderung mengalami modifikasi oleh
enzim 5-methylcytosine (5mc) dan 5 hydroxymethylcytosine (5hmC) oleh methyl-CpG binding domain (MBD) dan ten-
eleven translocation (TET). Supresi gen melalui metilasi melibatkan rekrutmen MBD sedangkan protein TET mengalami
demetilasi DNA aktif dan regulasi ekspresi gen.
________________________Keating ST, Plutzky J, El-Osta A. Epigenetic changes in diabetes and cardiovascular risk. Circ Res. 2016;118:1706-1722.
Stem Cell Epigenetik
51
Gambar 10. Profiling epigenom pada sel monosit dan endotel manusia. Membedakan profil epigenom dari populasi sel
yang berbeda di dalam pembuluh darah. Misalnya, modifikasi histon dan sekuensi metilasi DNA genom yang diperoleh
dari sel monosit dan endotel memakai metode profiling epigenomik digabung dengan analisis dan integrasi
komputasi. Data asetilasi histon dari monosit CD14 dinilai oleh portal Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE). Data
asetilasi histon dan metilasi DNA dari sel endotel aorta manusia diperoleh dari GEO (Gene Expression Omnibus; ID:
GSE37378). Plot ini menunjukkan bahwa pola asetilasi histon dan metilasi DNA di dalam kromosom 17. Dengan peaks
yang dihasilkan secara seragam memakai MACS (Model-based Analysis of ChIP-Seq) membandingkan sampel
dengan input sekuensi pada dua jenis sel. Panjang peak berbanding lurus dengan kekuatan peak (dikalkulasi dengan niali
P). Asetilasi monosit ditunjukkan dengan warna ungu. Asetilasi sel endotel dengan warna biru, sedangkan regio metilasi
dengan warna merah. Trek terdalam menunjukkan promoter gen dari HAECs dengan asetilasi histon (hijau) dan
deasetilasi (orange) diinduksi oleh histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid. Semua gen pada
kromosom 15 berada pada bagian terluar (biru dengan garis luar merah). Nama-nama gen berhubungan dengan asetilasi
histon pada promoter.
________________________Keating ST, Plutzky J, El-Osta A. Epigenetic changes in diabetes and cardiovascular risk. Circ Res. 2016;118:1706-1722.
Bukti saat ini menunjukkan bahwa mekanisme
epigenetik yang mendasari semua proses
aterosklerosis yang didahului oleh disfungsi endotel.
Diabetes meningkatkan proses aterogenesis melalui
proses peningkatan ekspresi adhesi dan faktor
kemotaktik pada sel endotel pada milieu diabetik, 23
hiperglikemia yang menginduksi migrasi dan
proliferasi vascular smooth muscle cells,24 dan
peningkatan akumulasi makrofag.25 Meskipun
predisposisi genetik berkontribusi signifikan
terhadap aterosklerosis, namun studi genome-wide
association menunjukkan bahwa komponen yang
diwariskan ini hanya memberi fraksi kecil
terhadap penyakit kardiovaskuler. 26 sebab itu,
perubahan epigenetik yang berimplikasi terhadap
kejadian molekuler mendasari perubahan
aterogenik.19
Dibandingkan dengan sampel aorta orang sehat
dengan aorta orang yang mengalami aterosklerotik
menunjukkan bahwa epigenetic signature pada
aterosklerosis ditandai dengan hipermetilasi CpG
2. Epigenetik : Ilmu Baru Genetik
52
pada pembuluh darah yang mengalami
aterosklerosis, dengan perubahan spesifik terhadap
fungsi gen yang berhubungan dengan homeostasis
vaskuler. 27 Follow-up akhir-akhir ini menunjukkan
bahwa loki CpG pada plak aterosklerotik terjadi
peningkatan metilasi dengan progresivitas lesi.28
Akumulasi deep-sequencing dataset yang dilakukan
proyek Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE)
memungkinkan genome-wide map yang
menunjukkan pentingnya chromatin signature yang
berdasar tipe sel (Gambar 10).19,29 berdasar
pemahaman ini terhadap epigenom yang mendasari
lesi aterosklerotik akan membuka tabir terhadap
perkembangan dan progresivitas penyakit sehingga
dapat ditranslasikan ke dalam pengobatan baru.
Pertanyaan sekarang yaitu bagaimana menjelaskan
memori biologik yang ditimbulkan oleh respon
epigenetik terhadap hiperglikemia sebelumnya pada
pasien diabetes mellitus tipe 2, meskipun telah
diobati dengan berbagai obat hipoglikemik, namun
tidak menurunkan komplikasi makrovaskuler secara
signifikan ?
Produksi reactive oxygen species (ROS) oleh
mitokondria akibat hiperglikemia mendasari
berkembangnya injuri vaskuler pada diabetes yang
mengaktivasi 4 jalur utama dalam patogenesis
komplikasi kardiovaskuler termasuk aktivasi protein
kinase C, produksi advanced glycation end product
(AGE), polyol pathway flux, dan jalur heksamin.30
ROS yang dimediasi hiperglikemia merupakan
pemicu memori glikemik pada pembuluh darah.
Protein disandi gen yang mencegah akumulasi ROS,
baik uncoupling protein-1 atau manganese
superoxide dismutase secara efektif dapat
menghilangkan aktivasi transkripsi dari marker
hiperglikemik pda sel endotel vaskuler, termasuk
RELA. Aktivasi persisten yang menghasilkan ROS
memicu memori proinflamasi dari
hiperglikemia, misalnya peningkatan enzim protein
kinease C (PKC)-ß dan NAD (P) H oxidase subunit-
47 phox meskipun glukosa telah normal di dalam sel
endotel manusia. 31 Penelitian akhir-akhir ini
menunjukkan sekuele modifikasi epigenetik yang
memodulasi ekspresi gen pro-oksidant dan
proinflamasi yang mendasari stres vaskuler
persisten. 32
Dalam studi Paneni et al., terhadap sel endotel aorta
manusia,33 dan mencit diabetes, menunjukkan bahwa
aktivasi protein mitokondria dan mediator stres
oksidatif p66Shc oleh elevasi PKC ßII meskipun
telah terjadi normoglikemia. Dengan silencing
pp66shc yang dimediasi siRNA pada saat
normalisasi glukosa mengurangi produksi ROS
mitokondria, mengembalikan ekspresi PKC ßII ke
arah basal, mengurangi inhibisi eNOS dan
ketersediaan nitric oxide dipulihkan, sekaligus
menekan peningkatan metilglioksil persisten.
Perubahan epigenetik secara konsisten mendasari
memori hiperglikemia. Histone deacetylase inhibitor
kelas III secara signifikan meningkatkan p66Shc
mRNA dan ekspresi protein pada sel endotel vena
umbilikasli manusia. 34 Hal ini berimplikasi bahwa
perubahan pada asetilasi histon, dengan peningkatan
transkripsi p66Shc selama hiperglikemia diperburuk
oleh histone deacetylase kelas III SIRT 1 dan
dengan overekspresi enzim yang sama dapat
mengembalikan fungsi.
Penemuan ini berdampak pada implikasi komplikasi
kardiovaskuler pada diabetes. Hiperglikemia
menginisiasi peningkatan regulasi epigenetik
ekspresi pp66Shc dan produksi ROS yang
mengaktivasi PKC ßII, selanjutnya mempertahankan
level pp66Shc, yang dipicu oleh peningkatan
asetilasi histon H3 yang dimediasi GCN5, sehingga
meningkatkan ROS yang bergantung pada
perubahan epigenetik oleh enzim seperti set7. Selain
sebagai penghasil utama ROS, p66Shc juga
mengurangi antioksidan manganese superoxide
dismutase, sehingga terjadi akumulasi ROS di dalam
endothelium vaskuler. 32,34 Hal ini menunjukkan
bahwa legacy hiperglikemia spike pada diabetes
dapat menimbulkan konsekuensi patologik yang
lama. Mengatasi aktivitas ekspresi terhadap pp66Shc
dengan SIRT1, GCN5 dan Set7 berpotensi terhadap
pengurangan komplikasi kardiovaskuler diabetika. 19
Dalam studi Zhoe et al., mendapatkan bahwa SIRT1
menghambat ekspresi p66shc, melindungi terhadap
disfungsi endotel yang ditimbulkan oleh
hiperglikemia.34
MICRORNA
Noncoding RNA terutama microRNA memiliki
peranan penting dalam perkembangan dan penyakit
kardiovaskuler. 35,36,37,38,39 Hal ini disebabkan sebab
sistem kardiovaskuler memiliki kerentanan terhadap
perubahan ekspresi gen yang ditimbulkan oleh
microRNA, sehingga jika terjadi gangguan, dapat
berakibat kelainan berat dan fatal. 40 Small
noncoding RNA atau dikenal microRNA yaitu
untaian tunggal RNA berjumlah kurang lebih 22
nukleotida yang berfungsi menghambat ekspresi
pada target mRNA melalui komplementer terhadap
Stem Cell Epigenetik
53
pasangan Watson-Crick antara seed region miRNA
dengan sekuensi yang terletak pada 3’untranslated
regions (UTR). 40 Jadi, microRNA yaitu regulator
penting terhadap ekspresi gen posttranskripsi. 41,42,43
Penelitian eksperimental menunjukkan bahwa setiap
microRNA berperan penting dalam berbagai
penyakit jantung (Gambar 11), 40 misalnya miR-1,44
miR-133,45 dan miR -208a 46 berimplikasi terhadap
aritmia, miR-21,47 dan miR-29 48 terhadap fibrosis,
miR-208 46,49 dan miR-133 50 terhadap remodeling
diinduksi pressure overload dan gangguan
metabolik.51
Bagaimana peran masing-masing microRNA
terhadap penyakit jantung ? Famili miR-29
mengalami downregulated setelah infark miokard
yang berarti fungsinya menurun, sehingga
menghambat ekspresi protein matriks ekstraseluler
dan kolagen, dan berkontribusi pada pembentukan
jariangan parut dan fibrosis. 52 miR-21 berperan
penting dalam meningkatkan hipertrofi dan fibrosis
jantung dalam respon terhadap pressure overload.
Dengan melakukan knowdown terhadap miR-21
dengan antagomir, dapat mengurangi remodeling
jantung setelah kontriksi aorta torakalis. 47
Gambar 11. Fungsi miRNA pada kondisi normal dan penyakit jantung. Semua tanda panah menunjukkan kerja normal
dari masing-masing komponen atau proses. MiR-1 dan miR-133 terlihat dalam perkembangan jantung normal (kiri)
dengan mengatur proliferasi, diferensiasi dan konduksi jantung. Misalnya, proliferasi ditingkatkan oleh regulator siklus
sel, tetapi miR-1 dan miR-133 menghambat regulator tersebut. miR 208a mengatur sistem konduksi. miRNA
berkontribusi terhadap perubahan remodeling setelah terjadi injuri jantung (kanan). miR-29 dan miR 21 masing-masing
memblok dan meningkatkan fibrosis jantung. miR-29 memblok fibrosis dengan menghambat ekspresi komponen ECM,
sedangkan miR-21 meningkatkan fibrosis dengan merangsang signaling mitogen-activated protein kinase (MAPK). miR-
209 mengatur myosin isoform switching hipertrofi dan fibrosis jantung. miR-23a meningkatkan hipertrofi jantung dengan
menghambat proteolysis ubikuitin, yang menghambat hipertrofi. Hipoksia memicu represi miR-320 dan miR-199,
yang masing-masing meningkatkan dan menghambat apoptosis. ECM, extracellular matrix; LV, left ventricle; MHC,
myosin heavy chain; RV, right ventricle.
Kemampuan masing-masing miRNA dalam
memodulasi jalur penyakit yang kompleks melalui
targeting terhadap beberapa komponen, membuat
miRNA dapat memodulasi respon jaringan terhadap
stres. Hal ini tentu berbeda dengan kerja obat klasik.
Target miRNA multipel ini memungkinkan miRNA
dapat menempuh mekanisme pintas sehingga
membuat sel atau jaringan tidak sensitif terhadap
satu jenis obat, melalui mutasi terhadap target obat
atau desensitisasi terhadap reseptor permukaan sel.
Mekanisme ini tidak mengurangi sensitivitas
inhibitor miRNA, yang dapat menargetkan pada
beberapa jalur penyakit.40
METODE PEMERIKSAAN EPIGENETIK
PEMERIKSAAN METILASI DNA
Berbagai jenis pemeriksaan tersedia dalam
melakukan pemeriksaan metilasi DNA, termasuk :
Southern blot hybridization, bisulfite sequencing,
COBRA (combined bisulfite restriction analysis),
MSP (methylation-specific PCR), Real-time MSP,
MethyLight, Pyrosequencing, dan MassARRAY. 53
Jika ingin dianalisis metilasi DNA sebagai penyebab
gene silencing, perlu dianalisis regio spesifik yang
mengatur ekspresi gen.54
Setiap teknik memiliki ciri tersendiri termasuk
jumlah DNA diperlukan, fleksibilitas dalam memilih
tempat CpG untuk dianalisis, kuantitas teknik,
kompleksitas teknik dan harga. Umumnya jumlah
DNA yang diperlukan kecil, kecuali teknik
Southern-blot hybridization. Yang mudah dilakukan
yaitu teknik COBRA, MSP. Real time MSP,
Methylight, dan MassARRAY, sedangkan yang lain
tergolong intermediate. Teknik Southern dapat
mendeteksi metilasi/tidak metilasi pada tempat CpG
yang spesifik, sedangkan bisulfite sequencing
menganalisis pola metilasi pada masing-masing
molekul DNA.
PRINSIP PEMERIKSAAN METILASI DNA
Analisis metilasi DNA dilakukan berdasar
identifikasi 5-methylcytosine (Cm) dari cytosine
dengan memakai enzim restriksi yang sensitif
terhadap metilasi. Aktivitas enzim ini dipengaruhi
oleh adanya gugus metil pada tempat CpG di dalam
tempat resktriksi (Gambar 12). 53 Enzim resktrisi
metilasi, seperti HpaII dan SmaI, bersifat tidak aktif
pada tempat CpG, dan McrBC, tidak aktif pada
tempat unmethylated CpG. Dengan memakai
teknik Southern-blot Hybridization dapat
mendeteksi perbedaan pemecahan.
Gambar 12. Metode deteksi metilasi DNA. Deteksi memakai ezim restriksi sensitif terhadap metilasi. Genom DNA
dicernakan enzim restriksi (HpaII dalam gambar) saat tempat restriksi (CCGG) dalam kondisi tidak metilasi, tapi tidak
dicernakan saat tempat ini dimetilasi. Apakah genom DNA dicernakan atau tidak tergantung kondisi status metilasi
berada dalam DNA original. Cm singkatan dari metilasi cytosine. (B) Deteksi oleh konversi DNA dimediasi bisulfite.
Unmethylated cytosine dikonversi dengan cepat menjadi uracil dengan deaminasi sedangkan methylated cytosine
dikonversi dengan amat lambat. sebab itu, perbedaan status metilasi pada tempat CpG dapat dkonversi menjadi
perbedaan sekuensi, UpG atau CpG. Setelah konversi DNA dimediasi bisulfite, untaian ganda atas dan bawah tidak lagi
komplementer.
55
Gambar 13. Prinsip analisis metilasi memakai
sekuensi bisulfit. Setelah diperlakukan dengan sodium
bisulfit, residu cytosine tidak metilasi dikonversi menjadi
uracil sedangkan methylcytosine (5mC) tetap dipengaruhi,
Setelah amplifikasi PCR, residu uracil dikonversi menjadi
thymine. Status metilasi DNA ditentukan memakai
sekuensi PCR atau sekuensi kloning.
Prinsip kedua bergantung pada konversi DNA
dimediasi bisulfite. Perlakuan ini dengan cepat
mengubah unmethylated C menjadi uracil,
sedangkan perubahan ke methylated C amat
lambat55. Status metilasi pada tempat CpG dapat
dikonversi menjadi sekuensi, UpG atau CpG, dan
saat konversi telah berubah menjadi sekuensi
DNA yang berbeda, maka dapat dideteksi
memakai teknik bisulfite sequencing, MSP, real
time MSP, COBRA, pyrosequencing, dan
MassARRAY (Gambar 12). 53
Status metilasi ditentukan melalui sekuensi produk
PCR (deteksi status metilasi rerata) atau sekuensi
sub klon (deteksi distribusi molekul tunggal dalam
pola metilasi) (Gambar 13 ).55 Analisis sekuensi
bisulfit tidak hanya mengidentifikasi metilasi DNA
di sepanjang untaian tunggal DNA, tetapi juga
mendeteksi pola metilasi DNA dari untaian ganda
sebab untaian DNA yang telah dikonversi tidak
komplementer dan produk amplifikasi dapat diukur.
sebab itu, sekuensi genomik bisulfit dianggap
sebagai teknik gold standard dalam mendeteksi
metilasi DNA sebab dapat mengidentifikasi 5-
methylcytosine secara kualitatif, kuantitatif pada
pasangan basa tunggal.55
TEKNIK PEMERIKSAAN
Southern-blot Hybridization
Status metilasi pada tempat yang telah dikenal enzim
restriksi dapat dimonitor dengan melihat band
fragmen DNA yang diapit tempat restriksi.
Keuntungan teknik yaitu kuantitasnya dapat
menggambarkan jumlah molekul DNA yang
dicernakan atau tidak. Teknik ini terutama
digunakan untuk menganalisis sekuensi ulangan
sebab mampu mendeteksi sekuensi multipel di
dalam genom. Kekurangan yaitu analisis tempat
CpG terbatas dan memerlukan jumlah DNA yang
banyak. Saat ini, teknik ini jarang digunakan,telah
diganti teknik bisulfite.
Bisulfite Sequencing
DNA yang telah dikonversi bisulfite diamplifikasi
PCR memakai primer yang ada pada regio
yang kurang memiliki tempat CpG. Produk PCR
disekuensi, biasanya setelah kloning produk PCR,
dan tempat CpG diamplifikasi (Gambar 14A).53
Basa cytosine (C) dan thymine (T) pada tempat
CpG pada DNA yang dikonversi menunjukkan
masing-masing methylated and unmethylated C.
Teknik ini memungkinkan investigasi status metilasi
pada setiap tempat CpG antara primers dan
bagaimana tempat CpG di dalam molekul DNA
tunggal dimetilasi. Dengan metode ini, dapat
dianalisis hampir setiap metilasi DNA. Kekurangan
teknik ini yaitu pekerjaan intensif memerlukan
sekurang-kurangnya 10 klon per satu sampel yang
disekuensi.
2. Epigenetik : Ilmu Baru Genetik
56
Gambar 14. Prinsip teknik analisis metilasi DNA. Tempat CpG methylated and unmethylated ditunjukkan masing-
masing dalam lingkaran tertutup dan terbuka. (A) Bisulfite sequencing. DNA yang dikonversi bisulfite diamplifikasi oleh
PCR dengan primer tidak ada pada tempat CpG. Produk PCR diklon, dan masing-masing klon disekuensi. Tenik ini
memberi pola metilasi pada molekul DNA pada tempat CPG. (B) COBRA, DNA yang dikonversi bisulfite
diamplifikasi oleh PCR dengan primer tidak ada pada tempat CpG, dan produk PCR dicernakan oleh enzim restriksi
(Taq) dalam gambar ini. Pada assay COBRA, jika cytosine pada tempat CpG dimetilasi, tempat restriksi tetap.
Sebaliknya, jika tempat tidak dimetilasi, restriksi akan hilang. Analisis kuantitatif dilakukan dengan gel elektroforesis.
(C) MSP, status metilasi pada beberapa CpG di dalam sekuensi primer dilakukan dengan PCR dengan primer pada
template metilasi dan tidak metilasi dan monitoring ada atau tidaknya PCR produk. Kondisi PCR dioptimalisasi
memakai DNA metilasi atau tidak metilasi. (D) Real time MSP. Jumlah molekul DNA metilasi dan tidak metilasi
dihitung dengan real-time MSP. (E) Pyrosequencing. Polimorfisme C/T pada produk PCR diteliti dengan mengukur
pirofosfat yang dilepaskan. Jumlah pirofosfat dikonversi menjadi signal seperti ditunjukkan dalam program. (F)
MassARRAY. Produk PCR diamplifikasi dari DNA yang dikonversi bisulfit ditranskripsi secara in vitro, dan dipecahkan
RNase A. Perbedaan dalam massa pada produk C dan T (16 Da) dideteksi dengam mass spectrometry.
COBRA (Combined Bisulfite Restriction
Analysis)
Teknik ini didasarkan pada munculnya atau
hilangnya tempat pengenalan enzim restriksi setelah
konversi bisulfit (Gambar 14 B). 53 Jumlah rasio
molekul DNA yang dimetilasi atau tidak dapat
dihitung. Teknik ini dapat mendeteksi jumlah
metilasi pada tempat CpG dan kemudahan prosedur.
Kekurangannya yaitu tempat CpG yang dianalisis
terbatas.
MSP (Methylation-specific PCR)
Teknik ini dapat mencari status metilasi di dalam
beberapa tempat CpG dengan melakukan PCR pada
tempat yang spesifik untuk sekuensi metilasi dan
tanpa metilasi dan mengamati ada atau tidak adanya
produk PCR (Gambar 14 C). 53 Molekul DNA
dengan pola mosaik tidak diamplifikasi. Teknik ini
mudah dilakukan dan memiliki fleksibilitas tinggi
dalam menseleksi regio genomik untuk dianalisis
sebab primer dapat dirancang pada posisi
sembarangan, meskipun regio yang dianalisis kaya
CpG. Kekurangan yaitu mudah mendapatkan hasil
positif dan negatif palsu.
Real Time MSP dan Methylight
Teknik ini dilakukan dengan deteksi real time dari
produk MSP. Dengan membandingkan amplifikasi
uji sampel dengan sampel standar yang berisikan
jumlah molekul DNA yang telah diketahui, maka
jumlah molekul DNA yang dimetilasi dan tidak
dimetilasi dapat dihitung (Gambar 14 D).53 Produk
PCR dapat dideteksi dengan pewarnaan seperti
SYBR Green I (real time MSP) atau Tag-Man probe
(Methylight). 56 Teknik ini memiliki fleksbilitas
tinggi selama menyeleksi regio genom yang
dianalisis seperti MSP, dan perhitungan jumlah
metilasi DNA akurat dan sensitif. sebab itu, cocok
digunakan untuk analisis jumlah sampel besar dalam
klinis.
Pyrosequencing
Pyrosequencing dapat mendeteksi tingkat metilasi
pada setiap tempat CpG dalam produk PCR yang
diperoleh dari primer untuk sekuensi metilasi dan
tanpa metilasi setelah konversi bisulfite. Jumlah C
dan T pada masing-masing tempat dikonversi
menjadi beberapa pirofosfat yang dilepaskan dari
metode ekstensi primer. Jumlahnya dapat dihitung
memakai sistem Pyroseqencing (Qiagen)
(Gambar 14 E). 53 Keuntungan teknik ini yaitu
akurasi dalam jumlah dan kemudahan prosedur.
Kekurangan yaitu sulit merancang primer yang
sesuai.
MassARRAY
MassARRAY mendeteksi tingkat metilasi pada
masing-masing tempat CpG di dalam produk PCR
memakai primer untuk sekuensi metilasi dan
tanpa metilasi setelah konversi bisulfite. Dengan
teknik ini, PCR dilakukan dengan reverse primer
bersama dengan T7 promoter tag. Transkrip in vitro
dapat dipecahkan oleh RNase A, yang mencernakan
basa pirimidin (Gambar 14 F). 53 MassARRAY
amat baik digunakan untuk menghitung jumlah
metilasi DNA di dalam tempat CPG dalam jumlah
sampel yang banyak, hanya harga instrumen yang
mahal.
PEMERIKSAAN MODIFIKASI KROMATIN
CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION
(ChIP)
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) pertama kali
dikembangkan oleh Gilmour dan Lis 57,58 dan
Solomon dan Varshavsky 59 melibatkan sel hidup
dengan formaldehid untuk memfiksasikan protein ke
dalam substrat DNA di dalam
sel.(tulisangambar15,hapus)60 Kromosom yang
mengalami crosslink diekstraksi dan difragmentasi
oleh enzim. Kemudian dilakukan isolasi dengan
pemurnian immune-afinitas memakai antibodi
terhadap protein. Fragmen yang dimurnikan
dilakukan assay dengan beberapa teknik seperti
Southern blot atau polymerase chain reaction (PCR),
untuk menentukan hubungan sekuensi DNA dengan
protein.61,62 Metode untuk mendeteksi interaksi
protein-DNA pada genom jamur memakai
DNA microarrays (ChIP-chip) dikemukakan tahun
2000. 63,64 Perkembangan teknologi selanjutnya
yaitu memakai high throughput sequencing
(ChIP-seq) membuka lembaran baru dalam analisis
berbasis ChIP terhadap kontrol gen dan epigenom,
memungkinkan surveilen terhadap seluruh genom
tanpa bias yang dilakukan chip sebelumnya. Jadi,
ChIP yaitu suatu alat yang bermanfaat untuk
mempelajari interaksi protein-DNA dan perubahan
kromatin yang berhubungan dengan ekspresi gen.
2. Epigenetik : Ilmu Baru Genetik
58
sebab itu, dapat dikumpulkan data epigenetik yang
meliputi seluruh genom. Teknik ini memungkinkan
penkayaan fragmen DNA yang terikat pada protein
spesifik dan identifikasi sekuensi spesifik dari
fragmen memakai microarrays, meliputi
sekuensing genom (tiling arrays) atau next-
generation DNA sequencing (Gambar 15). 65
Chromosome confirmation capture (3C) pertama
kali dikembangkan oleh Dekker, yang menentukan
interaksi antara setiap pasangan loci dari genom di
dalam sel. 66,67 Sama seperti ChIP, 3C memakai
formaldehid untuk melakukan crosslinking pada sel
untuk mempertahankan interaksi genom untuk
dilakukan analisis. Crosslinked chromatin
dicernakan dengan enzim resktriksi dan DNA
genom yang dicernakan diligasi dalam kondisi untuk
mempertahankan ligase intramolekuler dari segmen
kromatin. Crosslink kemudian dibalikkan dan
campuran ligase dimurnikan. 3C akan menghasilkan
produk genome-wide ligation dengan masing-
masing produk ligase berhubungan dengan suatu
interaksi spesifik antar kedua loci di dalam nuklei
(Gambar 16). 60
Gambar 15.Identifikasi interaksi protein-DNA pada tingkat genome-wide memakai chromatin imunoprecipitation
(ChIP) atau microarrays berbasis (ChIP-on-chip) atau next generation sequencing technology platform (ChIP-seq).
Gambar 16. Teknik ChIP dan 3C. Sel yang dikutur atau primer dengan perlakuan formaldehid menjadi crosslink DNA
berikatan dengan protein di dalam loci in situ. Nuklei crosslink diproses dengan ChIP seperti pada panel kiri atau 3C pada
panel kanan. Nuklei DNA difragmentasi menghasilkan segmen DNA berhubungan dengan protein (kotak, segitiga,
lingkaran)). Protein yang diteliti (segitiga hitam) diseleksi dengan immune-affinitiy precipitation, dan crosslink
dibalikkan. Hasil DNA co-presipitasi dianalisis dengan whole-genome microarray (ChIP-chip) atau high-throughput
sequencing (ChIP-seq). Untuk menganalisis lipatan 3 dimensi, 3C memakai kromatin crosslink yang dicernakan
dengan enzim resktriksi dan ligasi dibawah kondisi larut menjadi ligase intramolekuler dalam DNA. DNA ligasi
dimurnikan dan dianalisis dengan PCR, DNA microarrays, atau sequencing.
Dengan metode berbasis ChIP dapat diketahui
struktur dan fungsi dinamika epigenom. Misalnya,
dengan metode ini dapat diketahui histon marks
pada sel T CD4+ yang dilakukan oleh dua studi yang
saling berkaitan (Gambar 17).60 Studi ini dapat
menjelaskan fungsi modifikasi histon. Kalau H3K27
dan K9 di- dan trimetilasi (H3K27 me2 dan me3 dan
H3K9-me2 dan me-3) dikonfirmasi sebagai
repressive marks, maka monometilasi dari residu ini
berhubungan dengan promoter aktif. H2BK5
monometilasi berhubungan degnan downstream
transcription start sites.
2. Epigenetik : Ilmu Baru Genetik
60
Gambar 17. Promoter aktif dan silent pada histone marks.
Distribusi histone marks aktif (kiri) versus silent (kanan).
Backbone 17 dari active chromatin marks ditunjukkan
dengan huruf tebal. Me-1, me2, me3, mono-di- tri- methyl
masing-masing. Ac= acetyl.
METILASI DNA PADA RISIKO DAN
PENYAKIT KARDIOVASKULER
Kondisi metilasi DNA berperan penting terhadap
regulasi proses biologik yang mendasari penyakit
kardiovaskuler (PKV), seperti aterosklerosis,
hipertensi dan inflamasi. 68,69,70 Misalnya, mencit
dengan genom hipometilasi memiliki peningkatan
ekspresi marker inflamasi, 71 dan hipometilasi DNA
merupakan awal pembentukan garis lemak di dalam
aorta. 72 Pada ApoE-null mencit yang cendrung
aterosklerosis, perubahan metilasi DNA terjadi pada
leukosit darah perifer dan aorta sebelum
pembentukan lesi vaskuler. 73 Perubahan ini
berperan terhadap peningkatan inflamasi dan
aterosklerosis. Jika jaringan jantung orang normal
dibandingkan dengan pasien dengan gagal jantung,
jaringan yang berpenyakit menunjukkan perubahan
metilasi pada gen yang berhubungan dengan
angiogenesis juga ekspresi. 74
Gambar 18. Metilasi DNA biasanya berhubungan dengan transkripsi inaktif dan supresi ekspresi gen. Gambar
menunjukkan mekanisme molekuler menghubungkan metilasi DNA dengan transkripsi inaktif. Cytosine dimetilasi
menjadi 5-methylcytosine oleh DNA methytransferase (DNMT). Ikatan methyl CpG binding protein terhadap sekuensi
metilasi mencegah akses sekuensi oleh faktor transkripsi, sehingga menekan transkripsi. MBP menunjukkan methyl CpG
binding protein; SAM, S-adenosylmethionine; dan SAH, S-adenosylhomocysteine.
Perubahan metilasi DNA yang berhubungan dengan diet dapat berpengaruh terhadap PKV pada manusia.
Stem Cell Epigenetik
61
Flavonoid, sebagai antioksidan, memberi
proteksi terhadap penyakit jantung, sebab dapat
mengurangi DNMT 75,76,77 (DNA methyltransferase)
yang mengubah DNA metilasi menjadi 5
methylcytosine (Gambar 18), 78 sehingga terjadi
peningkatan level metilasi DNA. Pada North Texas
Health Study, peserta yang mengkomsumsi tinggi
sayur-sayuran dan buah-buahan memiliki sekuensi
ulangan LINE-1 (long-interspersed nucleotide
repetitive elements-1) lebih tinggi dibandingkan
dengan orang yang memakan tinggi lemak dan
karbohidrat. 75 Penelitian Normative Aging Study
dilaksanakan di Boston mendapatkan bahwa subjek
dengan prevalensi penyakit jantung iskemik dan
stroke yang tinggi memiliki metilasi LINE-1 lebih
rendah. 79
Hubungan metilasi DNA dan perokok dewasa
terhadap gen AHRR dapat dilihat pada fibroblast dan
makrofag alveolar. 80 Penelitian kembar monozigot
mendapatkan adanya perubahan metilasi antara
kembar perokok dan bukan perokok di dalam 8 loki,
termasuk loki AHRR dan FeRL3. Perbedaan metilasi
DNA juga diamati pada perokok sekarang versus
terdahulu, pemaparan merokok kumulatif (jumlah
rokok dihisap seumur hidup), dan waktu berhenti
merokok (di antara mantan perokok). 81,82 Perubahan
metilasi DNA dalam respon terhadap merokok
berhubungan dengan merokok dan PKV 83,84,85,86
menunjukkan bahwa adanya peran metilasi DNA.
Pemaparan terhadap faktor lingkungan seperti polusi
udara, logam berat, dan arsenik, dapat menginduksi
stres oksidatif dan memicu inflamasi, yang
berkontribusi terhadap aterogenesis melalui
peningkatan sitokin, disfungsi endotel, trombosis
dan artimia. 87 Partikel polusi udara berhubungan
dengan onset infark miokard dan risiko penyakit
jantung dan stroke jangka panjang. 88,89,90,91,92 Studi
menunjukkan udara partikel dalam udara lembab,
94,94 logam dan zat racun merubah metilasi DNA
pada elemen repetitif, juga gen spesifik.95,96,97
INTERVENSI EPIGENETIK DALAM
MENCEGAH PENYAKIT
KARDIOVASKULER
Dengan memahami pengaruh epigenetik terhadap
PKV, terutama epigenom yang dapat menjadi target
untuk dilakukan intervensi, sehingga dapat
diterjemahkan pengetahuan ini dalam praktek.
Misalnya, metilasi DNA bergantung pada siklus
biokimia yang memerlukan donor metil, maka
intervensi diet dapat dilakukan berupa komsumsi
asam folat, vitamin B6, B12, metionin, betaine, dan
kolin. 78 Metilasi DNA juga sensitif terhadap zinc,
98 flavonoid, 99 vitamin C,100 dan niacin.101 sebab
itu, analisis epigenetik baseline dapat digunakan
untuk mengidentifikasi individu yang mendapat
manfaat dari intervensi nutrisi.
Keseimbangan diet fitokimia dan kesehatan
merupakan hubungan antara manusia dan alam
(Gambar 19). 102 Berbagai senyawa polifenol seperti
resveratrol, tea catechins, dan flavonoid, dijumpai di
dalam sayur-sayuran, buah-buhan dan juice tumbuh-
tumbuhan atau minuman memberi efek
kardioprotektif, neuroprotektif, kemopreventif dan
anti-inflamasi. Mekanisme manfaat fitokimia yaitu
: 1. Aktivitas antioksidan atau meningkatkan
ekspresi protein antioksidan; 2 mengurangi stress
signaling endoplasmic retikulum; (3) menghambat
sitokin anti-inflamasi; (4) menghambat faktor
transkripsi berhubungan dengan penyakit metabolit;
(5) menginduksi ekspresi gen metabolik; (6) aktivasi
faktor transkripsi yang mengantagonis inflamasi. 103
Makanan ini memiliki aktivitas epigenom dan
menentukan respon adaptif terhadap stres,
metabolisme energi, homeostasis imun, dan fisiologi
tubuh. 104,105,106,107
Bukti akhir-akhir ini mengemukakan peran
hiperhomosisteinemia terhadap penyakit vaskuler
dimediasi oleh akumulasi adenosyl-homocystein (Hcy)
dan metilasi DNA. Hcy berkompetisi dengan SAM
(donor gugus metil) (Gambar 18),78 berikatan dengan
DNMT, yang memicu hilangnya metilasi secara
pasif dalam replikasi DNA. Kadar Hcy tinggi dalam
darah berkorelasi dengan hipometilasi DNA dan
aterosklerosis sehingga memicu reduksi metilasi
DNA sebesar 35% di dalam limfosit darah perifer.
109,110,111,112 Hal yang sama terjadi pada insulin glukosa,
folat atau diet kaya flavanol mengganggu metabolisme
donor metil dan pool SAM, memicu perubahan
metilasi DNA. 112,113,114,115 sebab itu, makanan kelas
spesifik dapat dirancang untuk modulasi epigenetik
terapeutik terhadap penyakit gaya hidup seperti PKV,
dan diabetes. Studi epidemiologik dan antropologik
medis telah menunjukkan bahwa diet kaya flavanol
seperti pada coklat berhubungan terbalik dengan risiko
kardiovaskuler.116,117,118,119,120,121,122
2. Epigenetik : Ilmu Baru Genetik
62
Gambar 19. Mekanisme regulasi epigenetik dari senyawa nutrisi. Modulasi berbagai kromatin writer-eraser oleh
fitokimia (panel kiri). Gen yang menyandi protein absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi (ADME) diregulasi
secara epigenetik menentukan respon masing-masing nutrisi. Modifikasi epigenetik terhadap gen yang berhubungan
dengan penyakit dapat berkontribusi terhadap diagnosis (biomarker) juga pencegahan atau progresivitas penyakit (panel
kanan).
Berbagai senyawa nutrisi (seperti epigallocatechin
gallate, resveratrol, genistein, curcumin,
isothiocyanates, withaferin A) (Gambar 19) 102 telah
diketahui dapat mengintervensi writers, readers
kromatin, atau eraser seperti DNMT, histon kelas I-
IV deacetylase (HDACs), histone acetyl transferase
(HATs), dan HDAC sirtuin (SIRTs) kelas III yang
memodulasi respon inflamasi dan senesen
imunologik.123,124,125,126 HDAC yaitu metaprotein
zinc yang bergantung pada Zn2+ untuk aktivitasnya
dan dibagi atas empat kelas berdasar
homologinya dengan HDAC jamur. HDAC kelas III
disebut sebagai sirtuins, tidak bergantung zinc tetapi
nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+).
Inhibitor HDAC kelas I-IV mengandung gugus
terdiri dari thiolate, thiol, hycroxamate, karboksilat,
mercaptoamide, epoxide atau keton yang bersifat
Zn2+ chelating. Flavonoid, yaitu activator HDC
kelas III ( SIRTs). 102
tem cell yaitu sel yang memiliki dua sifat
utama : self-renewal dan berdiferensiasi. 1,2
Secara eksplisit, stem cell mampu menghasilkan sel
anak yang identik dengan sel induk melalui mitosis
(self-renewal), juga menghasilkan sel anak (progeni)
dengan potensi terbatas (sel terdiferensiasi). 3
Dengan kapasitas self-renewal berarti mampu
menghasilkan kembali satu sel progeni yang
memiliki fenokopi yang sama dengan sel induk dan
satu progeni berdiferensiasi. Sehingga stem cell
dideskripsikan sebagai ‘immortal’, ‘unlimited’ atau
‘kontinu’ dalam kapasitas replikasi sel. 3 Istilah
“immortal” ini ditinjau dari “replicative ageing”
kurang tepat, sebab sel progeni dapat mengalami
proses “penuaan.” 5
Self-renewal pada stem cell bertujuan untuk
membuat lebih banyak stem cell melalui
pembelahan simetris yaitu menghasilkan dua stem
cell, misalnya pada awal perkembangan embrio yang
normal, pembelahan stem cell yang bersifat transien
ini untuk pertumbuhan tubuh.4 Sedangkan
pembelahan asimetris yaitu menghasilkan satu
stem cell dan satu sel anak terdiferensiasi dengan
kemampuan diferensiasi terbatas.4 Sifat self-renewal
menjadikan stem cell dapat memberi jumlah
suplai sel tanpa terbatas, sedangkan potensi
diferensiasi memungkinkan stem cell menghasilkan
S
3
Stem Cell Epigenetik
69
semua jenis sel. Sifat ini membuat stem cell dapat
digunakan dalam kedokteran regeneratif. 5
Secara fungsional, stem cell memiliki sifat
potensi sebab mampu menghasilkan progeni yang
terdiferensiasi. Stem cell yang mampu menghasilkan
satu organisme disebut totipoten, misalnya ada
pada zigot. Stem cell yang mampu berdiferensiasi
menghasilkan 3 lapisan sel germinal disebut stem
cell pluripoten; lapisan ektoderm, mesoderm dan
endoderm. 4 Stem cell pluripoten dapat dijumpai
pada embrio pre dan post-implantasi. 3 Multipotent
stem cell yaitu stem cell yang dapat menghasilkan
lebih dari satu jenis sel tetapi dalam jumlah terbatas,
misalnya pada adult stem cell. Stem cell ini
merupakan progeni dari stem cell pluripoten
sehingga sifat plastisitas terbatas. Kapasitas self-
renewal amat penting bagi kelangsungan fungsi
adult stem cell, misanya hematopoietic stem cell dan
spermatogonial stem cell – untuk dapat
mengembalikan fungsi jaringan dengan masa turn
over yang cepat, misalnya pembentukan darah
(hematopoiesis). sebab itu, dalam bab ini akan
dipaparkan strategi dan proses pembelahan pada
self-renewal pada adult stem cell dan embryonic
stem cell, mekanisme yang mendasari, dan
pengaturan self-renewal pada tingkat epigenetik.
STRATEGI SELF-RENEWAL
Dengan melakukan pembelahan asimetris, stem cell
memiliki strategi untuk melakukan dua tugas dalam
sekali pembelahan (Gambar 1 a,b). 6 Dengan strategi
ini, stem cell belum mampu memperbanyak
jumlahnya yang amat diperlukan saat pool stem
cell diperlukan untuk perkembangan 7,8,9 dan saat
terjadi injuri untuk regenerasi 9,10,11,12,13 sebab itu,
diperlukan strategi self-renewal untuk memenuhi
jumlah yang diperlukan. 5
Stem cell melakukan pembelahan secara simetris
untuk self-renewal sekaligus menghasilkan sel
progeni yang terdiferensiasi. Pembelahan simetris
yaitu menghasilkan dua sel anak atau sel
terdiferensiasi, yang dibutuhkan saat terjadi injuri
atau penyakit yang memerlukan banyak stem cell
(Gambar 1 c). 6 Stem cell dapat mengadakan
pembelahan secara asimetris atau kombinasi
pembelahan simetris dan asimitris (Gambar 1 d). 6
Gambar 1. Strategi stem cell. a, stem cell (orange) melakukan self-renewal dan menghasilkan sel terdiferensiasi (hijau).
B-d, strategi mempertahankan keseimbangan stem cell dan progeni terdiferensiasi. B, pembelahan sel asimetrik; setiap
stem cell menghasilkan satu sel anak dan satu sel anak mengadakan diferensiasi. c, d, strategi populasi. Strategi populasi
memberi kontrol dinamik terhadap keseimbangan stem cell terdiferensiasi - kapasitas untuk memperbaiki setelah
injuri atau penyakit. Dalam skema ini, stem cell memiliki “potensi” untuk menghasilkan satu stem cell dan satu sel
terdiferensiasi pada setiap pembelahan. c, pembelahan sel simetrik; setiap stem cell dapat membelah secara simetrik
menghasilkan dua sel anak atau dua sel terdiferensiasi. d, kombinasi pembelahan sel: masing-masing stem cell dapat
membelah baik simetrik maupun asimetrik.
Gambar 2. Kontrol pembelahan stem cell. a. lokasi asimetik dari regulator polaritas sel (merah) memulai pembelahan
asimetrik. Pembelahan asimetrik ada pada kompleks PAR-aPKC pada satu ujung pembelahan sel. Stem cell
berwarna orange, dan sel terdiferensiasi berwarna hijau. b, penentu nasib sel (merah) berkumpul di sitoplasma pada satu
sel anak, atau berhubungan dengan membran, sentrosom atau konstituen sel lainnya, yang didistribusikan ke sel anak. c,
Orientasi spindle mitotic hanya dijumpai pada sel anak dari stem cell niche (merah), sebab sel anak memiliki akses
terhadap signal ekstrinsik yang diperlukan untuk mempertahankan identitas stem cell. Mekanisme ini mencapai
pembelahan asimetrik meskipun pembelahan ini sendiri secara intrinsik yaitu simetrik. Pada model yang sama, sel anak
ditempatkan jauh dari niche dipaparkan terhadap signal yang menginduksikan diferensiasi.
Ada dua mekanisme yang mendasari pembelahan
asimetris : mekanisme intrinsik dan mekanisme
ekstrinsik. Mekanisme intrinsik meliputi faktor
polaritas sel dan segregasi penentu nasib sel
(Gambar 2 a,b). 6 Hanya sel progeni yang keluar dari
stem cell niche sebab adanya signal ekstrinsik
untuk berdiferensiasi (Gambar 2c).6Meskipun secara
intrinsik berupa pembelahan simetris, namun terjadi
pembelahan asimetris sebab adanya pemaparan
terhadap signal eksterna. sebab itu, pada
pembelahan asimetrik proses benang pembelahan
dapat direproduksi sebab proses ini diregulasi
secara ekstrinsik dan intrinsik.
PENGATURAN STEM CELL SELF-
RENEWAL
STEM CELL NICHE
Dengan mengetahui pengaturan self-renewal stem
cell dan bagaimana stem cell diatur, maka dapat
diketahui sifat alamiah stem cell. Observasi pada
adult stem cell seperti hematopoietic stem cell
(HSC) menunjukkan bahwa potensi HSC akan
kehilangan self-renewal jika sel tersebut
dikeluarkan dari microenvironment (niche) dan
banyak faktor signaling dari niche secara
langsung mengatur sel progeni mengalami
diferensiasi. Jika ruang di dalam niche terbatas,
satu sel progeni akan digantikan di luar niche, dan
memulai diferensiasi sebab kurangnya faktor
self-renewal. Jika ruang niche ada, maka kedua
sel progeni dari hasil pembelahan stem cell akan
menyimpan identitas stem cell (misalnya, self-
renewal). sebab itu, stem cell niche memprediksi
bagaimana jumlah stem cell dikontrol oleh
keberadaan niche yang memberi signal
diperlukan untuk self-renewal dan survival.
Gambar 3. Sel niche (hijau) berada di basement
membrane memberi signal ke stem cell (merah) untuk
memblok diferensiasi dan mengatur pembelahan. Jika
mekanisme garis turunan menonjol (pembelahan sel
rendah), pembelahan stem cell dengan satu sel anak
berhubungan dengan niche, yang lain (kuning) terlepas
dan memulai diferensiasi. Sebaliknya, jika mekanisme
populasi menonjol (pembelahan sel tinggi), pembelahan
stem cell dapat menjadi simetrik (terlihat pada gambar)
atau asimetrik (tidak ditunjukkan), ditentukan oleh faktor
local. ECM, extracellular matrix.
Mekanisme interna yang mengatur pola pembelahan
sel dan menentukan nasib sel anak yaitu melalui
ekspresi gen. Berbagai signal dan interaksi
interseluler turut menentukan tingkah laku sel yang
tidak terdiferensiasi. Schofield mengemukakan
bahwa pengatur hematopoietic stem cell (HSC)
yaitu pada satu regio yang dikenal sebagai niche
(Gambar 3). 14 Niche tersusun atas jaringan sel atau
substrat ekstraseluler yang menyangga satu atau
lebih stem cell dan mengatur self-renewal dan
produksi sel progeni secara in vivo. 14 Niche juga
menunjang polaritas orientasi sel progeni misalnya
satu sel progeni ditempatkan di luar niche untuk
mengadakan diferensiasi (Gambar 3). 14
EMBRYONIC STEM CELL (ESC)
Selama pembentukan embrio, sel mengalami proses
dari sifat proliferatif and pluripoten menjadi sel yang
terbatas dalam potensi diferensiasi. Martin Evans
dan Kaufman menemukan pluripotent cell lines,
dikenal sebagai embryonic stem (ES) cells yang
berasal dari inner cell mass di dalam blastocyst
mencit, tahun 1981. 15 Atas penemuan ini, Martin
Evans bersama Mario Capecchi dan Oliver Smithies
dianugrahi hadiah Nobel. Kultur ES cell diperoleh
dari satu sel tunggal dapat berdiferensiasi menjadi
beberapa tipe sel, atau membentuk teratokarsinoma
jika disuntikkan ke dalam mencit. 16
Dengan adanya leukemia inhibitory factor (LIF),
suatu faktor pertumbuhan, di dalam kultur (secara in
vitro) yang mencegah diferensiasi dan meningkatkan
proliferasi, ES cell mencit dapat mempertahankan
self-renewal, atau kondisi proliferasi dan
undifferentiated terus-menerus selama bertahun-
tahun, 17 serta dijumpai pada sel epiblast berusia
4.5 hari (E.4.5), dan jika disuntikkan ke dalam
blastocyst, maka memicu pertumbuhan
embrio, menghasilkan seluruh sel embrio dan
germline.18 Kemampuan ES cell dalam
mempertahankan perkembangan embrio ini dikenal
sebagai naive pluripotency atau ground pluripotent
state. 19,20 Jadi, ES cell yaitu stem cell yang berasal
dari epiblast preimplantasi yang mempertahankan
naïve pluripotensi melalui self-renewal. 20
Sebaliknya, epiblast stem cell (EpiSC) berasal dari
epiblast atau ectoderm primitif embrio
pascaimplantasi. EpiSC mencit mempertahankan
self-renewal sebab adanya fibroblast growth factor
(Fgf2) dan Activin dan jarang berkontribusi terhadap
embrio kimera setelah disuntikan ke dalam
blastocyst, dan dikenal sebagai primed
pluripotency.4
Secara in vivo, keadaan pluripotensi selama
perkembangan zigot totipoten menjadi blastocyst.
Pada tingkat proses ini terbagi atas dua garis turunan
: inner cell mass (ICM), sebagai pembentuk
pluripotensi, dan trophectoderm (TE), yang
membentuk lapisan epitel ekstraembrionik yang
melapisi dan menyokong ICM (Gambar 4). 19 Pada
blastocyst tingkat akhir (E-4.0). ICM berkonsolidasi
membentuk garus turunan yang mengekspresikan
Nanog dan lapisan ekstraembrionik dengan
endoderm primitif yang mengekspresikan Gata-6
(dikenal sebagai hipoblast). 21 Epiblast yang terbagi
ini masuk ke dalam perkembangan “ground state”,
sebagai asal perkembangan seluruh sel embrio
(Gambar 4). 19
Epiblast akan berkembang menjadi ectoderm
primitif pada tahap embryogenesis. Ektoderm
primitif dapat dibedakan dari ICM, sebab tidak
menghasilkan trophectoderm dan endoderm primitif
(Gambar 5), 17 juga morfologi epitel yang berbeda
dari ICM. 22 Ektoderm primitif yaitu satu-satunya
sel lineage dengan mempertahankan pluripotensi dan
menghasilkan tiga lapis embrio dan sel germinal
primordial (Gambar 5). 17 Namun, kurang mampu
berdiferensiasi menjadi ekstraembrionik, endoderm
primitif dan trophectoderm. sebab itu,
dibandingkan dengan ICM, tingkat pluripotensi
ektoderm primitif lebih kecil atau “terbatas. 17
Pluripotensi didefinisikan sebagai kemampuan
menghasilkan semua tipe sel dari satu embrio terlepas
dari trophoectoderm (prekursor pembentuk plasenta),
dan menghasilkan seluruh sel embrio dan dewasa. 23,24
Hal ini disebabkan analisis awal pada embrio kimerik
mencit, yang dihasilkan dari suntikan sel ICM dan sel
ES ke dalam embrio dengan jumlah sel sebanyak 8
atau blastocyst. 25 Namun, ICM masih mampu
menghasilkan trophectoderm lineage, juga ES cell
dalam kondisi kultur. 26
Dalam beberapa tahun terakhir, studi telah
mengemukakan peran faktor transkripsi dan proses
epigenetik dalam mempertahankan pluripotensi ES
cell.26,27,28,29,30,31 Fungsi faktor transkripsi bergantung
pada tahap perkembangan sel pluripoten. Hal ini
menunjukkan bahwa faktor-faktor ini berfungsi
bersama dengan proses lain. 32 Aktivitas faktor
transkripsi juga bergantung pada akses gen target,
yang dapat dibuat lebih mudah atau tidak terhadap
modifikasi DNA nya, histon, atau struktur
kromatin.33
3. Stem Cell Self-Renewal
72
Meskipun ES cell dikatakan bersifat pluripoten,
diferensiasi menjadi 3 tipe sel : ectoderm pritmitif,
endoderm primitif dan sel trophectoderm, analog
dengan kemampuan diferensiasi ICM. Diferesiasi ECS
cell mencit dapat diinduksi oleh ekspresi ektopik dari
faktor transkripsi tertentu, Misalnya ekspresi faktor
transkripsi Gata6 pada ES cell menghasilkan
diferensiasi menjadi endoderm primitif. 34 Juga
ekspresi caudal-type homeobox transcription factor
(Cdx2) menginduksi ES cell berdiferensiasi menjadi
trophectoderm. 26 sebab itu, faktor-faktor ini menekan
ES cell menjadi self-renewal.17
Gambar 4. Pembentukan pluripotent ground state secara in vivo. Perkembangan zigot berlanjut melalui pembelahan
membentuk morula, yang berkembang menjadi blastocyst terdiri dari trophectoderm ekstraembrionic (TE) dan inner cell
mass pluripotent. ICM mengekspresikan Gata6 (hijau) dan Nanog (biru) tetapi selanjutnya berkembang masing-masing
menjadi extraembryonic primitive endoderm (PrE) dan pluripotent naïve epiblast (EPI) secara mutually exclusive. EPI
yaitu sumber pembentukan seluruh sel embrio, termasuk germline, sehingga dikenal sebagai perkembangan “ ground
state.”
Gambar 5. Embrio mencit dengan pluripotent lineage. Perkembangan preimplantasi dalam bentuk skema. (A) Stem cell
pluripoten (hijau) pada perkembangan morula menjadi inner cells (B) membentuk inner cell mass (ICM) blastocyst. (C)
Setelah menjadi endoderm primitive pada permukaan ICM, stem cell pluripotent membentuk epiblast dan memulai
proliferasi secara cepat setelah implantasi. (D) Membentuk ectoderm primitif, epitelium berlapis tunggal yang membatasi
pluripotensi dan menghasilkan germ cell lineage dan membentuk somatic lineage embrio. Faktor transkripsi tertentu
(biru) diperlukan untuk diferensiasi berbagai embryonic lineages (garis turunan embrio).
EMBRYONIC STEM SELF-RENEWAL
DENGAN MENCEGAH DIFERENSIASI
Self-renewal dari ES cell dapat dipertahankan
dengan mencegah diferensiasi dan meningkatkan
pluripotensi. Untuk penelitian in vitro pada
mencit, sangat dibutuhkan satu faktor kunci yaitu
leukemic inhibitory factor (Lif) untuk mencegah
diferensiasi. Sebenarnya, kondisi kultur optimal
untuk self-renewal yang kuat pada ground state
(naive pluripotent) pada ES cell mencit terdiri
dari 3 adiktif 2i yaitu suplemen LIF (CHIRON,
PD03, LIF) (Gambar 6),19 yang terutama
berpengaruh terhadap masing-masing jalur WNT,
FGF/ERK, dan JAK/STAT. 19 Namun, kombinasi
dari dua dari antara tiga sudah cukup
mempertahankan naïve self-renewal, paling tidak
untuk menguji genetik. 35,36
Lif yaitu family sitokin interleukin-6 berikatan
dengan reseptor heterodimerik terdiri dari Lif receptor-
ß dan gp130. Ikatan ini memicu aktivasi jalur
Jak/Stat (Janus kinase signal transducer and activator of
transkription). 17 Aktivasi Stat amat penting dan cukup
mempertahankan EC cell mencit, 37,38 dan c-Myc
yaitu target dari Stat3.39
Faktor transkripsi famili POU Oct3/4, yang disandi
oleh Pou5f1, juga regulator pluripotensi,40 yang
bekerja sebagai pengawal untuk mencegah
diferensiasi ES cell. Represi artifisial terhadap Oct
3/4 pada ES cell menginduksi diferensiasi sepanjang
trophectodermal lineage, saat overekspresi ES cell
berdiferensiasi menjadi primitive endoderm-like cell
(Gambar 7B). 17,27 Oct3/4 dilaporkan secara
langsung mencegah diferensiasi menjadi
trophoectoderm yang berinteraksi dengan Cdx2
(faktor pemicu diferensiasi trophectoderm (Gambar
7D,E). 17
Gen target yang mencegah ES cell dari diferensiasi
menjadi endoderm primitif dengan merepresi faktor
pencetus yaitu Gata6. Nanog yaitu NK-2 class
homeobox transcription factor yang diekspresikan
sepanjang sel pluripoten ICM. Overekspresi Nanog
pada ES cell dapat mempertahankan keadaan
pluripoten tanpa Lif, sehingga dikenal sebagai
repressor Gata6. 28,30 Namun, dilaporkan bahwa
ekspresi Nanog sebagian diregulasi oleh Oct3/4 dan
Sox2, suatu anggota famili Sox (SRY-related HMG
box). 41,42 Meskipun overekspresi Nanog pada ES
cell yang memblok diferensiasi ES cell menjadi
endoderm primitif (diinduksi oleh penarikan Lif)
atau pembentukan embryoid bodies (EB : struktur
menyerupai bola yang membentuk ES cell pada
suspensi kultur dan menyerupai diferensiasi
mesoderm), tidak ada bukti langsung bahwa Gata6
direpresi oleh Nanog. 17
Gambar 6. Jalur signaling ekstrinsik yang memperkuat dan mengantagonis naïve pluripotency. Berbagai kaskade
signaling berpengaruh terhadap self-renewal. Tanda panah menunjukkan aktivasi, sedangkan bar menunjukkan inhibisi
atau blok terhadap aktivitas target. Garis tebal menunjukkan target downstream dan garis-terputus-putus yaitu efek tidak
langsung. Sesuai jarum jam : BMP4 ada dalam serum dan berfungsi via SMADs mengaktivasi gen Id. LIF signaling
berpengaruh terhadap banyak jalur tetapi terutama bekerja pada fosforilasi dimediasi JAK pada STAT3, yang
mengaktivasi Ecfp211 dan Klf4. Signaling WNT kanonikal memblok aktivasi GSK3 memicu stabilisasi ß-catenin,
yang sebaliknya menghilangkan represi gen pluripotensi yang dimediasi TCF3, termasuk Esrrb. CHIRON mirip dengan
signaling WNT dengan menginhibisi GSK3. Signaling FGF mengaktivasi jalur MAPK memicu fosforilasi MEK,
yang sebaliknya mengadakan fosforilasi dan mengaktivasi ERK. ERK yang aktif meningkatkan transisi menjadi keadaan
“primed”, yang dihambat oleh inhibitor MEK yaitu PD03.
Gambar 7. Diferensiasi ES cell mencit. (A) ES cell mencit berdiferensiasi menjadi 3 tipe sel –endoderm primitif,
trophoectoderm (TE) dan ektoderm primitif –menyerupai potensi diferensiasi pada stem cell pluripoten pada embrio
preimplantasi. (B-E) Berbagai kondisi kultur dapat menginduksi ES cell berdiferensiasi menjadi turunan tertentu. (B)
tanpa Lif dan adanya kelebihan Oct 3/4, ES cell berdiferensiasi menjadi primitive endoderm-like cell, sedangkan (C)
tanpa Nanog dan adanya Gata6, akan berdiferensiasi menjadi parietal endoderm-like cell. (D,E) Dengan mengeluarkan
Oct 3/4 dari dan menambah Cdx2 ke dalam kultur ES cell menginduksi diferensiasi TE-like. MEFc, mouse embryonic
fibroblast conditioned medium.
Gambar 8. Regulasi ES cell pada mencit. Faktor transkripsi pluripoten mengaktivasi ekspresi efektor tertentu (B) yang
meningkatkan proliferasi ES cell. D iantaranya, Eras dan Tcl1 merangsang jalur signaling fosfoinositol 3-kinase
(PI3K)/Akt untuk meningkatkan siklus sel, sedangkan b-Myc dan c-Myc mengaktivasi progresivitas siklus sel secara
langsung. Bagaimana Utf1 dan Sall4 mempengaruhi proliferasi EC sel tidak diketahui.
EMBRYONIC STEM CELL SELF-RENEWAL
MELALUI PROLIFERASI
Dengan kondisi kutur optimal, ES cell dapat
mengadakan pembelahan simetris setiap 12 jam
dengan Lif. Selama self-renewal, sebagian besar ES
cell berada dalam fase S dari siklus sel, dengan
sedikit dalam fase G1.43 Penemuan akhir-akhir ini
mendapatkan bahwa jalur fosfoinositol-3-kinase
(PI3K)/Akt signaling memegang peranan penting
dalam memingkatkan proliferasi, survival dan/atau
diferensiasi ES cell mencit (Gambar 8). 17 Delesi
Pten, yang menyandi regulator negatif PI3K pada ES
cell mencit dilaporkan meningkatkan viabilitas,
proliferasi ES cell, 44 dan aktivasi Akt cukup
mempertahankan self-renewal ES cell tanpa Lif. 45
Dua modulator jalur PI3K)/Akt yang secara spesifik
diekspresikan pada ES cell, Eras dan Tcl1 (Gambar
8). 17, 46 Eras menyandi molekul kecil GTPase dari
famili Ras yang mengaktivasi PI3K untuk
merangsang proliferasi ES cell dan tumorigenisitas
setelah transplantasi ektopik secara in vivo. 47 Produk
gen Tcl1 meningkatkan aktivasi Akt dengan
membentuk kompleks heterodimerik dengan Akt. 48
Knockdown Tcl1 pada ES cell dapat mengganggu
self-renewal dengan menginduksi diferensiasi
dan/atau represi proliferasi. 49,50 Namun, mekanisme
molekuler secara langsung mengekspresikan Eras
dan Tcl1 pada ES cell belum diketahui. 17
MEKANISME EPIGENETIK TERHADAP
EMBRYONIC STEM SELF-RENEWAL
Protein grup Polycomb (PcG) berfungsi terutama
untuk menstabilkan struktur kromatin represif.
Polycom-repressive complex 2 (PRC2) terdiri dari
Exh2, Eed dan Suzl2 di dalam ES cell, berfungsi
sebagai histone methyltransferase pada lysine 27
(K27) dari histone H3, sehingga menghasilkan tri-
metilasi (H3K27me3), suatu methylation mark yang
berhubungan dengan gen transkripsi inaktif.51
Secara umum, distribusi chromatin mark represif
bersifat mutuallly exclusive dengan H3K4me3, yang
berhubungan dengan regio aktif. 52,53 Berstein et al.,
melaporkan bahwa pada ES cell mencit ada
histone mark yang memiliki lokasi sama pada
tempat khusus dikenal sebagai “bivalent domain.”
Domain ini tersusun atas elemen kromatin pendek
ditandai oleh H3K4me3, yang berhubungan dengan
gen yang diekspresikan pada tingkat rendah
(Gambar 9B). 17, 54
Gambar 9. Karakteristik epigenom pluripoten. (A) Nuklei
undifferentiated (kiri) dan differented (kanan) dari ES cell.
Nukleus mengecil dan area distribusi dengan densitas
elektron, terutama heterokromatin, berubah secara
dramatis saat ES cell diinduksi terdiferensiasi menjadi
endoderm primitif oleh ekspresi ektopik Gata6 (hasil
mikroskop elektron). (B) Gambaran epigenetik sel nukleus
pluripoten. Volume nukleus membesar pada sel
berdiferensiasi sebagai akibat dari relaksasi struktur
kromatin. ada regio kecil heterokromatin tetapi
kebanyakan yaitu eukromatin, sehingga histone mark
berhubungand dengan aktivitas transkripsi. Hiperdinamik
protein kromatin (hijau) berkontribusi terhadap
pemeliharaan eukromatin. Bivalent domain juga
merupakan gambaran pluripoten epigenom, dengan
histone mark (misalnya H3K4me) diapit oleh histone mark
represif (H3K9me).
Separuh dari bivalent domain berisikan tempat target
yang umum dari Oct3/4, Sox2, dan Nanog, yang
dianalisis dengan ChIP-on-ChIP. 29 Jadi, domain ini
menunjukkan gen struktur kromatin dalam kondisi
siap untuk berdiferensasi. 55 Lee et al., melakukan
analisis pemeriksaan ChIP-on-ChIP untuk Suz12,
Eed dan H3K27me saling tumpang tindih dan
mendapatkan H3K27me3 mark berada pada regio
dengan gen silent, termasuk Gata4 dan Cdx2 pada
ES cell. Sebanyak 1800 gen yang dideteksi sebagai
target Suz12 termasuk target represif oleh Oct3/4,
Sox2 dan Nanog.29 Boyer et al.,juga
mengidentifikasi 512 target gene PRC2 dan PRC1
3. Stem Cell Self-Renewal
76
dengan analisis ChIP-on-ChIP dan menemukan
bahwa ada H3K27 me3 mark yang bersifat
represif. Penemuan ini menunjukkan bahwa jalur
perkembangan represif pada ES cell oleh proses
epigenetik diperlukan untuk mempertahankan
pluripotensi, tetapi perlu dilakukan studi lanjut. 17
Ekspresi beberapa gen pada kondisi pluripotensi ES
cell yaitu sebagai akibat proses genetik dan
epigenetik. Pada proses epigenetik, epigenom
pluripoten mempertahankan struktur kromatin terbuka,
sehingga memungkinkan regulasi genetik dengan cepat
(Gambar 9B). 17,54 Banyaknya chromatin marks aktif
seperti H3K4me3 dan H4c pada ES cell menunjukkan
kesesuaian terhadap kondisi ini. 57,58 Kromatin
hiperdinamik yang diamati pada ES cell mencit selama
self-renewal yaitu sebagai akibat pertukaran histone
H1 dan HP1œ, 59 sehingga berkontribusi terhadap
struktur kromatin terbuka. Hal ini dibuktikan adanya
perbedaan distribusi dan frekuensi densitas elektron
tinggi sebagai heterokromatin60 antara ES dan parietal
endoderm cell (Gambar 9B). 17, 54
SELF-RENEWAL PADA EMBRYONIC STEM
CELL MANUSIA
Potensi stem cell dibedakan berdasar potensi
perkembangan atas embryonic stem cell dan stem
pada jaringan postnatal (Gambar 10). 61 Stem cell
pluripoten memiliki sifat berbeda mulai dari embrio
preimplantasi dikenal sebagai embryonic stem cell,
sedangkan yang dihasilkan setelah perkembangan
embrio sebagai tahapan embryonic epiblast, dikenal
sebagai epiblast stem cell. 6,63 Kebutuhan kultur
ekspresi gen dan gambaran epigenetik membedakan
perkembangan pluripotensi di dalam embrio. Istilah
naïve dan primed menggambarkan epiblast tahap
dini dan lanjut dan merupakan derivat masing-
masing dari embryonic stem cell dan EpiSC. 64
Gambar 10. Potensi stem cell. a. Dua assay utama menilai potensi stem cell pluripoten yaitu kimera blastocyst dan
pembentukan teratoma. Penilaian assay menentukan klasifikasi potensi perkembangan atas totipoten, naive pluripotent,
primed pluripotent, dan multipoten. Totipoten yaitu kapasitas perkembangan dalam pembentukan suatu organisme,
termasuk jaringan ekstraembrio. Naïve pluripotent mampu membentuk teratoma dan kimera setelah diberikan pada
embrio preimplantasi, sedangkan primed pluripotent membentuk teratoma tanpa membentuk kimera setelah diberikan
pada embrio pre implantasi, Stem cell multipoten membentuk tipe sel yang berhubungan dengan asal jaringan, tetapi
tidak membentuk teratoma atau
.jpeg)
.jpeg)
