kimera. Epiblast SC menunjukan pluripoten jika diberikan pada embrio postimplantasi. b.
Pengujian untuk menilai fungsi dan keadaan sel pluripoten. Penilaian ‘fungsi’ dengan mengukur kapasitas self-renewal dan
potensi perkembangan dan melakukan validasi “kondisi” pluripotensi dengan mengukur kadar marker faktor transkripsi inti
OCT4, SOX2 dan NANOG dan karakteristik marker seperti faktor transkripsi dan metilasi DNA.
Stem cell pluripoten ditandai oleh mekanisme
molekuler yang mempertahankan self-renewal dan
menekan diferensiasi sekaligus mempertahankan
gen kunci diferensiasi dalam keadaan quiescent
namun”poised” atau siap untuk mengalami potensi
perkembangan.61Faktor transkripsi yang terlibat
dalam bentuk kombinasi yang mengatur pluripotensi
: OCT4 (juga dikenal sebagai POU5F1, SOX2 dan
NANOG, secara kolektif dikenal sebagai OSN.
OCT4 dan NANOG yaitu faktor transkripsi inti
berdasar pola ekspresi khusus di dalam stem cell
pluripoten dan embrio dini. dan identifikasi yang
berperan penting dalam pluripotensi pada mencit
dan manusia. 65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75 Fungsi OCT4
yaitu heterodimer dengan SOX2, menempatkan
SOX2 di antara regulator inti. 76 Ekspresi ektopik
OCT4 dan SOX2 dalam menghasilkan induced
pluripotent stem (iPS) cell pada mencit and manusia
mengkonfirmasi pluripotensi.65 Meskipun NANOG
tidak diperlukan untuk mempertahankan stem cell
pluripoten mencit, 73 dan ekspresi rendah atau tidak
ada pada epiblast stem cell (EpiSC), NANOG
menstabilkan stem cell pluripoten, dan diperlukan
untuk perkembangan ICM secara in vivo, 74 dan
diekspresikan pada tempat yang sama dengan OCT4
dan SOX2. 61
SIRKIT REGULASI FAKTOR
TRANSKRIPSI PADA EMBRYONIC STEM
CELL SELF-RENEWAL MANUSIA
Model awal sirkit regulasi transkripsi dibuat
berdasar identifikasi gen target dari OCT4,
SOX2, dan NANOG yang menyandi faktor
transkripsi dan regulator kromatin. Regulator
downstream pada manusia dan mencit berdasar
studi ekspresi dan literatur dapat dilihat pada
Gambar 11. 61 Model ini meliputi subset gen target
yang aktif dan represif berdasar karakteristik dari
353 gen. Target aktif meliputi komponen yang
menyandi gen dari remodeling kromatin dan
kompleks yang memodifikasi histon (misalnya,
SMARCAD1, MYSTT3 dan SET) yang berperan
pada regulasi transkripsi dan faktor transkripsi yang
menyandi gen (misalnya, REST, SKIL, HESX1 dan
STAT3), yang menyandi gen khusus. REST banyak
didapati pada ES cell dan berfungsi menekan gen
spesifik neuron. 77 NANOG berfungsi melalui jalur
TGF-ß pada ES cells. 78 OCT4, SOX2, dan NANOG
menempati tempat yang sama dengan STA3, suatu
regular kunci self-renewal pada ES cell mencit, 77
menunjukkan bahwa STAT3 berperan penting pada
ES cell manusia.
INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL
PLURIPOTENSI SECARA IN VIVO
Pluripotensi in vivo selama perkembangan, baik
melalui mekansime genetik dan epigenetik
terlibat dalam kondisi pluripotensi pada ICM
melalui reprogramming nuklei pada telur yang
dibuahi. 17 Aktivitas reprogramming terjadi pada
sitoplasma telur yang dibuahi, seperti lahirnya
embrio yang diklon dari somatic cell nuclear
transfer. 79,80 Namun, masih belum jelas
mekanisme yang berkontribusi terhadap aktivitas
sebab enzim yang memodifikasi kondisi
epigenetik, juga faktor transkripsi yang
ditranslasikan di dalam telur yang dibuahi.
Takahashi dan Yamanaka 65 melaporkan bahwa
pemberian transgen yang menyandi faktor
transkripsi Oct3/4, Sox2, c-Myc dan Klf 4 ke
dalam sel somatik, seperti fibroblast embrio dan
dewasa pada mencit dan manusia, menghasilkan
induced pluripotent stem cell (iPS) cells, yang
memberi embrio kimerik setelah disuntikan
ke dalam blastocyst mencit. Fungsi Oct3/4,
Sox2, dan c-Myc telah disebutkan sebelumnya,
Klf4 dikenal sebagai onkogen,81 tetapi
overekspresi Klf4 pada sel embrio mencit dapat
mengurangi kemampuan diferensiasi embryonic
bodies (EB). 82 Klf4 dapat berikatan dengan
promoter proksimal gen target Oct3/4, seperti
Leftyl, dan membantu mengaktivasi Oct3/4 an
Sox2. 83 Keempat faktor dipikirkan sebagai
pembentuk pluripotensi pada sel somatik dengan
mekanisme seperti pada Gambar 12. 86 c-Myc
meningkatkan replikasi DNA, dan
merelaksasikan struktur kromatin, sehingga
memungkinkan Oct3/4 masuk ke dalam gen
target. Sox2 dan Klf4 juga bekerja sama dengan
Oct3/4 mengaktivasi gen target yang menyandi
faktor transkripsi yang meningkatkan anyaman
faktor transkripsi pluripoten dan bersama dengan
Oct3/4, Sox2, dan Klf4, menghasilkan aktivasi
proses epigenetik pada epigenom pluripoten. 17
iPS cell memiliki profil ekspresi gen yang
sama dengan ES cell mencit. Yang menarik
yaitu bahwa Nanog tidak diperlukan sebagai
faktor transkripsi eksogen dalam membentuk iPS
cell dan ekspresi endogen tidak selalu diaktivasi
untuk membentuk stem cell pluripotensi oleh
keempat faktor. Hal ini mendukung hipotesis
bahwa Nanog berfungsi untuk mempertahankan
pluripotensi dan bergantung pada kondisi.
3. Stem Cell Self-Renewal
78
Gambar 11. Pembentukan nuklei sel somatik pluripotensi.
Studi Takahashi dan Yamanaka memakai empat
faktor Oct3/4, Sox2, Klf 4 dan c-Myc cukup membentuk
pluripoten nuklei fibroblast. Oct3/4, Sox2 dan Klf4
mungkin berfungsi bersama untuk mengaktivasi gen target
dalam pembentukan anyaman yang stabil dalam faktor
transkripsi pluripotensi, juga epigenom pluripoten,
sedangkan c-Myc meningkatkan masuknya gen target
dengan merangsang replikasi DNA.
MEKANISME INDUCED PLURIPOTENT
STEM CELLS PADA TINGKAT EPIGENETIK
Untuk mendapatkan induced plupotency dari
satu sel yang telah terdiferensiasi seperti sel
fibroblast mencit atau manusia, selain proses
yang memerlukan waktu sekitar 2 minggu dan
tidak efisien (0.1-3%) 65,84 faktor transkripsi
yang digunakan harus mengatasi beberapa
rintangan epigenetik terhadap genom selama
proses diferensiasi untuk menstabilkan identitas
sel dan mencegah perubahan nasib sel. 85 Studi
terdahulu menunjukkan bahwa populasi sel
yang mengekspresikan OKSM (Oct4, Klf4,
Sox2 dan c-Myc) melewati beberapa kejadian
pada tingkat molekuler dan celuler (Gambar
12). 86
Pada awalnya fibroblast mengurangi marker
yang berhubungan dengan keadaan somatik dan
selanjutnya mengaktivasi gen yang berhubungan
dengan pluripotensi, yang berarti adanya suatu
proses yang teratur. 87,88 saat iPSC yang baru
mengaktivasi gen inti pluripotensi termasuk
Oct4, Sox2, dan Nanog, maka sel yang terbentuk
telah mendapat keadaan pluripoten dan tidak
diperlukan faktor ekspresi dari luar (Gambar
13).65 Kejadian berikutnya bertepatan dengan
aktivasi silenced X chromsome pada sel somatik
betina, upregulasi telomerase dan pembentukan
immortality yang merupakan tanda sel
pluripoten.86.87
Gambar 12. Dinamika kejadian molekuler selama proses reprogramming seluler. Perubahan pada tingkat sel, transkripsi dan
epigenetik (bar berwarna) yang terjadi selama pembentukan induced pluripotent stem cell (iPSC) dari fibroblast dan contoh
regulator yang berhubungan dengan chromatin marks pada reprogramming langsung (kanan). Tanda panah merah
menunjukkan perjalanan waktu induksi faktor eksogen (+OKSM) dan penarikan (-OKSM). 5hmC, 5-hydroxymethylcytosine;
5mC, 5-methylcytosine; MET, mesenchymal-to-epithelial-transition; OKSM, Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc.
Gambar 13. (A) Efek pengeluaran faktor individu dari 24 faktor trankripsi pada pembentukan koloni yang resisten G418.
Fbx15geo/bgeo MEFs ditransduksi dengan faktor yang dipilih dengan G418 selama 10 hari (kolom putih) atau 16 hari
(kolom hitam). (B) Efek pengeluaran faktor individu dari10 faktor yang dipilih dalam pembentukan koloni yang resisten
terhadap G418 setelah tranduksi. (C) Efek transduksi pool dari empat, tiga, dan dua faktor terhadap pembentukan koloni
resisten terhadap G418 pada 16 hari setelah tranduksi. (D) Morfologi iPS-MEF4 (klon7), iPS MEF 10 (klon 6) dan iPS-
MEF 3 (klon 3). Skar bar = 200 mm. MEF : murine embryonic fibroblast.
Faktor Transkripsi Penentu Nasib Sel
Pluripotensi
Oct4, Klf4, Sox2 (OKS) yaitu satu kombinasi
faktor minimal yang dibutukan untuk
menghasilkan iPSC di bawah kondisi
reprogramming (dengan adanya serum dan sitokin
leukemic inhibitory factor, LIF). OKS bekerja
menekan lineage-specific genes dan mengaktivasi
gen yang berhubungan dengan embryonic stem
(ES) cell, sehingga membentuk sel yang
mempertahankan pluripotensi. 89 Sedangkan
ekspresi c-Myc secara signifikan meningkatkan dan
mempercepat reprogramming tetapi tidak
dibutuhkan dalam pembentukan iPSC. 90,91 Ekspresi
c-Myc berfungsi pada awal reprogramming, dengan
merangsang proliferasi dan menginduksi pergeseran
metabolik dari keadaan oksidatif menjadi glikolitik
yang merupakan ciri sel pluripotensi. 92,93 c-Myc
juga berperan dalam reprogramming dengan
menginduksi promoter RNA polymerase, sehingga
meningkatkan gen target. 94,95.
Keempat faktor transkripsi yang dikemukakan
Takahashi dan Yamanaka secara fungsional dapat
digantikan oleh faktor transkripsi lain, upstream
epigenetic modifier, microRNA (miRNA) atau
molekul kecil untuk mendapatkan iPSC. 84
Penelitian selanjutnya juga mendapatkan bahwa
iPSC juga diperoleh dari molekul yang sama sekali
tidak mengandung faktor transkripsi, 96,97
menunjukkan bahwa ada fleksibilitas di antara
faktor reprogramming (Gambar 14). 86 Misalnya,
studi akhir-akhir ini melaporkan bahwa Oct4 dan
Sox2 dapat digantikan oleh lineage specifier dini
seperti Gata3 dan Geminin. 98 Molekul ini masing-
masing berhubungan degan diferensiasi mesoderm
dan ectoderm. Juga menekan program lineage lain,
sehingga hal ini menunjukkan bahwa jalur
diferensiasi dapat memicu induksi IPSC. 86 Dengan
demikian dapat disimpulkan bahwa faktor
transkripsi reprogramming harus mencapai dua
tugas utama, yaitu menghilangkan program somatik
dan menginduksi keadaan pluripotensi stabil yang
khas untuk ES cells. 86
3. Stem Cell Self-Renewal
80
Gambar 14. Hubungan antara faktor reprogramming dengan molekul yang mempengaruhi keadaan kromatin. Faktor
transkripsi yang ditunjukkan dapat memicu induced pluripotency dengan kombinasi yang lazim digunakan (Oct4, Klf4,
Sox2, c-Myc). Beberapa jenis molekul dapat memfasilitasi (hitam) atau menginhibisi (merah) reprogramming. Bone
morphogeneic protein(BMP) dan Wnt masing-masing dapat meningkatkan atau menekan pembentukan iPSC bergantung
pada tahap pembentukan.
RBPs, RNA binding proteins
PERUBAHAN TARGET KROMATIN
SELAMA PROSES PEMBENTUKAN
INDUCED PLURIPOTEN STEM CELL
Studi akhir-akhir berhasil mengemukakan proses
penempatan OKSM dan histone marks pada awal
reprogramming pada fibroblast mencit dan manusia
yang menghasilkan iPSC. 99,100 ada 3 tahapan
target OKSM terhadap lokus berdasar asesibilitas
kromatin, penambahan remodeling dan kinetik
aktivasi transkripsi (Gambar 15 a). 86 Gen dengan
keadaan kromatin “terbuka” pada sel somatik terdiri
dari kelompok pertama sebagai target, ditandai
dengan peningkatan hipersensitivitas DNA ase,
histon H3 lysine di dan trimetilasi (H3K4 me2 dan
H3K4me3) dan kemampuan berikatan dengan
OKSM.
Target OKSM dini yang kedua meliputi distal
regulatory elements, memerlukan penambahan
remodeling kromatin untuk aktivasi transkripsi. 100
Distal regulatory element terdiri dari loki yang
resisten terhadap DNase-I yang tidak dapat berikatan
dengan c-Myc saja. 100 Gen pluripoten dini seperti
Sall4 termasuk kelompok ini. Penempatan target ini
oleh OKS memfasilitasi ikatan dengan c-Myc. Hal
ini mengidentifikasikan bahwa OKS yaitu ‘pioneer
factors” yang mampu berikatan dengan kromatin
somatik tertutup dan memungkinkan remodeling
kromatin juga rekrutmen faktor transkripsi dan
kofaktor.
Gen bivalen terdiri dari sekelompok target kromatin
yang ditandai oleh metilasi H3K4 aktif dan metilasi
H3K27 represif pada iPSC dan ES cell. 54 Gen di
Stem Cell Epigenetik
81
dalam kategori ini ditranskripsikan menjadi silent
pada ES cell dan iPS dan dalam keadaan siap
(poised) mengalami aktivasi cepat terhadap
komitmen lineage (Gambar 15 a). 86 Faktor
transkripsi Utf1 terlibat dalam regulasi bivalensi
melalui deposisi H2K27 mark represif dan degradasi
transkrip residual. 101Ekspresi Utf1 dapat
menggantikan beberapa faktor reprogramming awal,
hal ini menunjukkan bahwa pembentukan promoter
bivalen penting untuk mendapatkan pluripotensi. 102
Gambar 15. Tingkat regulasi epigenetik selama proses induced pluripotency. a, ada 4 kategori gen yang berhubungan
dengan modifikasi histon dan respon transkripsi selama reprogramming. Misalnya, gen yang ditunjukkan dalam tanda
kurung. B, Gain dan loss metilasi DNA terjadi pada akhir reprogramming, sedangkan hidroksimetilasi pada gen
pluripotensi terjadi pada tahap awal-pertengahan pembentukan iPSC. c, Fungsi Oct (O), Klf4 (K) dan Sox2 (S) sebagai
“pioneer factors” yang berikatan dengan regio nukleosom dengan kepadatan tinggi, memungkinkan remodeling kromatin
(tanda panah bertitik) dan rekrutmen faktor lain termasuk c-Myc (M). d, Perubahan pada interaksi long-range chromatin
di sekitar lokus Nanog (somatic-specific, loop berwarna orang; intermediate-specific, hijau dan pluripotent specific biru)
selama pembentukan iPSC. Pembentukan iPSC membentuk kembali hubungan kromatin 3-D, tanda khas ES cell, dan
proses ini bergantung pada mediator dan kohesi.
Metilasi DNA dianggap sebagai modifikasi
epigenetik yang paling stabil, membawa gene
silencing selama perkembangan dan pada dewasa. 86
Perubahan pada modifikasi kromatin mendahului
deposisi metilasi DNA marks selama proses
diferensiasi. 92 Demikian juga perubahan metilasi
DNA hampir selalu terjadi pada akhir proses
reprogramming dan setelah perubahan kromatin
terjadi, menunjukkan bahwa urutan kejadian dalam
proses perkembangan normal (Gambar 12). 86
Metilasi DNA terbentuk melalui enzim Dnmt2a dan
Dnmt3b methyltransferase de novo dan
dipertahankan oleh Dnmt1 methyltransferase. 103
Meskipun Dnmt3 knockdown meningkatkan
pembentukan iPSC pada sel manusia,104 delesi enzim
Dnmt3 dan Dnmt3b tidak memberi konsekuensi
terhadap reprogramming sel.105 Hal ini
menunjukkan bahwa lineage-specific genes terutama
terjadi melalui mekanisme alternatif yaitu deposisi
metilasi H3K27 represif, yang konsisten dengan
peran penting PRC2 dalalm pembentukan iPSC. 106
Enzim yang berhubungan dengan metilasi DNA
memiliki hubungan langsung dengan
pembentukan iPSC (Gambar 12). 86 Protein TET
mengkatalisis hidroksilasi 5-methylcytosine (5mc)
menjadi 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), yang
merupakan substrat untuk excision repair dari
unmodified cytosine. 103 Sesaat setelah overekspresi
OKSM, Tet2 menginduksi hidroksimetilasi dari gen
kunci sepeti Nanog and Esrrb, selanjutnya demetilasi
dan aktivasi transkripsi (Gambar 12 dan 15b). 86,107
Analisis proteomik dan genomik menunjukkan
bahwa Tet1 dan Tet2 secara langsung berinteraksi
dengan Nanog dan menempati target yang sama di
dalam ES cell, menunjukkan bahwa Nanog
merupakan target Tets. 108 Tet 1 atau Tet2 bersama
dengan Nanog secara signifikan meningkatkan
pembentukan iPSC dan sebaliknya deplesi Nanog
atau Tet2 menghilangkannya. 21,107,108
Struktur kromatin setempat dapat berpengaruh
terhadap posisi dan densitas nekleosom juga histon
varian (Gambar 14 dan 15c). 86 Histon varian
biasanya memodifikasi kemampuan nukleosom
mengalami remodeling dan mengakomodasi
modifikasi histon aktif dan represif. Histon varian
macroH2A berhubungan dengan resistensi
remodeling kromatin. 109 Struktur kromatin lokal
diatur oleh beberapa kompleks remodeling yang
berpengaruh terhadap pembentukan iPSC (Gambar
14). 86 Misalnya, kompleks SW1-SNF, seperti Brg1,
Baf155 dan Brm secara langsung merekrut Oct4
untuk merelaksasikan struktur kromatin dan
memfasilitasi ikatan dengan faktor transkripsi lain.
110 Penemuan ini menunjukkan bahwa Oct4 yaitu
pioneer factor yang berpengaruh terhadap perubahan
struktur kromatin setempat yang bersifat silenced
target. 111 Hal yang sama terjadi pada faktor
remodeling CHD misalnya Chd1 yang membuka
kromatin selama reprogramming yang diinduksi
faktor transkripsi. 111
Sebaliknya, kompleks NURD sebagai represif
termasuk Hdc1 dan Mbd3, yang penting sebagai
heterokromatin, menghambat reprogramming. Jika
gennya dilakukan knockdown, akan meningkatkan
efisiensi pembentukan iPSC (Gambar 16).112,113
Studi Rais et al., mendapatkan bahwa deplesi Mbd3
pada sel somatik memfasilitasi konversi ke
pluripotensi dengan efisiensi mendekati 100%, 113
Hal ini membuktikan bahwa Mbd3 yaitu faktor
yang menentukan naïve atau ground state
pluripotency pada ES cell dan sel somatik mencit
dan manusia (Gambar 16). 113 Jadi, Mbd3 dapat
menghambat reprogramming saat diberikan
sebelum tahap akhir reprogramming. Namun sekali
pluripotensi terbentuk, Mbd3 tidak mengganggu
pemeliharaan pluripotensi.113 Sebagaimana
disampaikan peneliti, bahwa modifikasi pendekatan
reprogramming ini dapat membentuk pluripotensi
dengan fleksibilitas dan resolusi yang menentukan
dan sinkron, yang sebelumnya bersifat asinkron dan
stochastic, sebab efisiensi mendapat sel induced
stem cell pluripoten hanya berkisar (0.1-3%). 113
Di samping struktur kromatin setempat, susunan
kromatin 3D telah diimplikasikan dalam proses
plutipotensi, diferensiasi dan reprogramming
(Gambar 15 c). 86,114 Diferensiasi ES cells diikuti
dengan reposisi gen pluripotensi dari nukleus di
tengah ke nukleus di perifer dan disrupsi promoter-
enhancer looping pada lokus pluripotensi seperti Oct
4 115,116 dan Nanog. 111,112 Studi akhir-akhir ini
mengidentifikasi interaksi kompleks pluripotency
specific long-range pada lokus Nanog, yang disusun
kembali selama diferensiasi dan reprogramming.116
Pembentukan dan pemeliharaan network ini
bergantung pada kompleks mediator dan kohesi
(Gambar 15d). 86 Subunit dari kompleks ini secara
langsung berinteraksi dengan faktor reprogramming,
117,118 dan dengan knockdown dapat menghambat
pembentukan iPSC. 117 Hal ini menunjukkan bahwa
faktor reprogramming tidak hanya mengaktivasi
atau melakukan silencing terhadap gen tetapi juga
berfungsi sebagai penyusun kromatin dengan
mengatur kembali struktur kromatin dari keadaan
somatik menjadi plutipoten.86
Stem Cell Epigenetik
83
Gambar 16. Melakukan deplesi ekspresi Mbd3 menfasilitasi pembentukan iPS manusia. 1. Secara in vitro fibroblast
terdiferensiasi dari MDB3 wt dan MBD3 mut dari iPS cell membawa transgen OKSM yang diinduksi doxycycline,
direprogram. Pluripotensi secara random dari sel yang diklon dengan pembentukan teratoma. b, Fibroblast C1 manusia
direprogram membawa transgen OKSM yang diinduksi doxycycline sesuai dengan protokol reprogramming.
Knockdown Mbd3 pada hari ke 2 dan ke 4, tetapi tidak dengan scrambled control siRNA, meningkatkan efisiensi
reprogramming secara nyata dievaluasi dengan pembentukan koloni NANOG/SSEA41 dan divalidasi secara in vivo
dengan pembentukan teratoma. Western blot mengkonfirmasi penurunan ekspresi protein MBD3 setelah transfeksi
dengan siRNA MBD3. Error bar menunjkkan s.d dari rata-rata (n 53). c, Perlakuan MBD3 siRNA pada fibroblast primer
manusia memungkinkan pembentukan sel IPS cell hanya dengan dua ronde reprogramming dengan transfeksi mRNA
dengan faktor OSKMdan LIN28 (OSKML). Representatif sel IPS cell manusia dengan waktu dan pasase berbeda (P,
jumlah pasase). Pluripotensi dari klon yang diseleksi ditunjukkan dengan pewarnaan OCT4 dan SSEA4 marker
pluripotency dan pembentukan teratoma. Hasil ini menunjukkan bahwa inhibisi ekspresi dan/atau fungsi MBD3
meningkatkan pembentukan iPSC cell dengan transien mRNA atau protokol transfeksi transien untuk reprogramming
iPS cell.
erbagai jenis stem cell manusia saat ini bisa
diisolasikan dan diperbanyak di luar tubuh atau
dikultur secara in vitro mulai dari embryonic stem
cell, adult stem cell meliputi hematopoietic stem
cell, hingga induced pluripotent stem cell (iPSCs),
sehingga dapat menjadikan suatu model
perkembangan manusia di dalam piring petri. 1 Stem
cell dapat dikultur dan ditumbuhkan dalam piring
petri tanpa batas waktu dan berdiferensiasi menjadi
berbagai jenis lineages (garis turunan) seperti
perkembangan secara in vivo dan/atau perbaikan
terhadap injuri. 1
Hematopoietic stem cell (HSC) dengan sifat
multipoten mampu berdiferensiasi menjadi seluruh
jenis sel darah yang berjumlah lebih dari 10 jenis sel
darah yang matur. 2,3 HSC dapat mempertahankan
keseimbangan antara self-renewal dengan
diferensiasi sepanjang hidup seseorang dengan
progeni yang telah berdiferensiasi. Dengan self-
renewal, berarti HSC dapat memperbanyak dirinya
tanpa diferensiasi.
Bab ini akan memfokuskan pada pembahasan
mengenai proses diferensiasi pada HSC, dengan
fokus pada penjelasan mekanisme epigenetik yang
mendasarinya, sebab HSC telah berhasil
digunakan dalam terapi hemato-onkologik selama
beberapa dekade dan juga nonhematologik.
Penjelasan dinamika epigenetik pada stem cell
pluripoten juga dibahas, seperti pada embryonic
stem cell.
POTENSI DIFERENSIASI HEMATOPOISTIC
STEM CELL
Satu sistem nomenklatur mengkategorikan potensi
diferensiasi dari berbagai populasi stem cell seperti
tampak pada Tabel 1.
B
4
4. Stem Cell Differensiasi
90
Tabel 1. Potensi Diferensiasi dari Populasi Stem Cell
ICM: inner cell mass, ES: embryonic stem, iPS: induced pluripotent stem, HSC: hematopoietic stem cell, NSC: neural
stem cell, CMP: common myeloid progenitor, CLP: common lymphoid progenitor.
Diikutip dari Seita J, Weissman IL. Hematopoietic Stem Cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med .
2010 ; 26: 640-653.
HSC yaitu stem cell somatik yang berada di
dalam sumsum tulang, dan jika ditransplansikan
ke dalam hewan yang diradiasi dengan dosis
subletal, mampu mengembalikan fungsi sistem
limfo-hematopoietik. 3 Konsep stem cell yang
pertama kali dipelopori oleh Till and McCulloch
yang melakukan transplantasi sumsum tulang ke
dalam mencit. Sepuluh hari kemudian, timbul
koloni di dalam limpa mencit yang memiliki sifat
: 1. Kemampuan menghasilkan sel mieloeritroid,
and kemampuan bereplikasi sendiri.4,5,6,7
berdasar pengamatan ini, diperoleh dua
kriteria stem cell yaitu multipotensi dan self-
renewal. 2 Di samping itu, juga dikemukakan
bahwa keputusan HSC mengadakan self-renewal
dan diferensiasi yaitu suatu proses stochastic
atau acak. 8 Ogawa et al., menguji model ini
secara in vitro dan mendapatkan bahwa produksi
koloni sel blast sekunder yaitu proses self-
renewal, sedangkan koloni multilineage yaitu
diferensiasi, 9,10 sebab distribusi kedua jenis
koloni amat heterogen seperti dilaporkan oleh Till
an McCulloch.
Marker permukaan pertama yang digunakan untuk
memperkaya HSC yaitu CD34, suatu ligand
terhadap L-selectin yang hanya diekspresikan
sebesar 0.5-5% di dalam sel darah hati fetus,
darah tali pusat dan sumsum tulang dewasa. 11,12,13
Pemeriksaan assay in vitro mendapatkan semua
sel CD34+ memiliki sifat multipotensi atau
oligopotensi, namun populasi masih sangat
heterogen. Isolasi HSC manusia memperlihatkan
fenotipe CD34+CD90+Lin-, dengan marker Lin
meiputi marker T,B, NK (Natural Killer), dan
mieloeritroid. Sel ini menghasilkan progeni
limfoid dan mieloid secara in vitro dan juga pada
mencit dengan severe combined immunodefiency
(SCID) secara in vivo. Sebaliknya populasi yang
tersisa dari CD34+ CD90- Lin- tidak mampu
menghasilkan klon sel yang mengandung tipe sel
mieloid dan limfoid. Namun, penkayaan HSC
melalui mobilisasi G-CSF ke dalam darah perifer
dengan ekspresi CD34 dan CD90 mampu
meningkatkan efisiensi transplantasi sumsum
tulang dengan memberi rekonstitusi dimediasi
hematopoietic dan engraftment jangka panjang
sekaligus mengurangi kontaminasi sel kanker atau
sel T yang imunoreaktif. 14,15,16 Sebenarnya semua
CD34+ CD9+ berada di dalam fraksi CD38- 17 ,
sehingga dapat disimpulkan bahwa HSC manusia
dapat diperkaya di dalam populasi Lin-
CD34+CD38-CD90+.
SUMBER HEMATOPOIETIC STEM CELL
Produksi stem cell darah terjadi pada berbagai
tempat sel embrionik (Gambar 1). 18 Urutan tempat
hematopoiesis pada mamalia meliputi yolk sac, area
di sekitar aorta dorsalis disebut aorta-gonad
mesonephros (AGM), hati fetus, dan sumsum tulang.
Plasenta juga dikenal sebagai tempat produksi
selama peralihan dari AGM ke hati fetus. Perbedaan
Penamaan Potensi Diferensiasi Contoh Stem/Progenitor Cell
Totipoten Semua jaringan embrio dan Zigot
Ekstraembrio
Pluripoten Semua jaringan embrio ICM, ES cell, iPSC
Multipoten Semua lineage (garis turunan) HSC, NSC
dari suatu jaringan/organ
Oligopoten Beberapa tetapi tidak semua CMP, CLP
Lineage dari suatu jaringan/organ
Unipoten Lineage tunggal dari suatu Macrophage progenitor
jaringan Sperma
Stem Cell Epigenetik
91
tempat hematopoiesis menggambarkan perbedaan
niche yang mendukung ekspansi HSC dan
diferensiasi pada setiap tahap perkembangan.
Misalnya, HSC pada massa hati fetus mengalami
siklus sel yang kontinu, sedangkan pada sumsum
tulang dewasa HSC umumnya bersifat quiescent
(dormant).
Sistem darah mamalia terdiri lebih dari 10 tipe sel
matur termasuk sel darah merah (eritrosit),
megakariosit/platelet, sel mieloid (monosit/makrofag
dan granulosit), sel mast, limfosit T dan B, natural
killer (NK) cells, sel dendritik dengan jumlah yang
diproduksi mencapai satu trillion (1012) setiap hari
pada orang dewasa. 2,19 Sumber tipe sel yang
beragam ini berasal dari satu sel progenitor umum,
yatu hematopoietic stem cell, yang memiliki
potensi diferensiasi yang luar biasa.
Perkembangan hematopoietik dengan diferensiasi
multipoten yang semakin ke bawah semakin
terbatas dalam hierarki struktur seperti terlihat
pada Gambar 2. 19 Pada mulanya, HSC
menghasilkan MPP (multipotent progenitor), yang
tidak lagi memiliki sifat renewal, tetapi populasi
MPP masih memiliki potensi diferensiasi untuk
pembentukan seluruh sel darah, 20,21 sebab sifat
heterogen. 21,22,23 MPP dapat berkembang menjadi
progenitor oligopoten : CLL (common lymphoid
progenitor (CLP) 24,25,26 dan common myeloid
progenitor (CMP). 27 Progenitor ini selanjutnya
menghasilkan sel efektor sistem hematopoietik,
yaitu CMP menjadi megakaryocyte/erythrocyte
progenitor (MEP) dan granulocyte/macrophage
progenitor (GMP). 28 Hubungan lineage antara
stem cell, progenitor, dan sel matur membentuk
satu ‘roadmap’ kompleks yang mengarahkan pada
penelitian dasar molekuler dari transisi
perkembangan. 19
HSC mencit pertama kali diisolasi sebagai populasi
(Lin-), c-kit+, Sca-1+ (LSK). memakai
multicolored fluorescence-activated cell sorting dan
monoclonal antibodies tahun 1988. 29,30 Di dalam
subset ada CD34- cell yang memiliki kapasitas
rekonstitusi multilineage jangka panjang dan self-
renewal. 22 Dengan melakukan isolasi HSC, dapat
dianalisis secara detail status transkripsi dan epigenetik.
31,32,33 Gambaran perkembangan sel hematopoietik
mencit dapat dilihat pada Gambar 2A.19
Isolasi HSC manusia menunjukkan fenotipe
CD34+CD90+Lin- dan marker Lin meliputi limfosit
T, B, NK, dan mieloerythroid (Gambar 2B). 19 Sel
ini menghasilkan progeni limfoid dan mieloid secara
in vitro dan in vivo pada mencit severe combined
immunodeficiency (SCID). Sebaliknya, sel
CD34+CD90- Lin- tidak mampu menghasilkan klon
sel yang mengandung tipe sel mieloid dan limfoid. 34
Penkayaan HSC lebih lanjut dalam populasi CD34+
menghasilkan marker permukaan CD38. Meskipun
90,9% sel CD34+ mengekspresi CD38, sel ini
mampu menghasilkan koloni multilineage
mengandung sel limfoid dan mieloid dengan fraksi
CD38 rendah hingga negatif dan fraksi CD90+.
35,36,37,38 Ekspresi CD34+ kurang dari 5% dari
seluruh komponen sel darah, dan merupakan marker
pertama dijumpai di dalam HSC dan progenitor
manusia, 11 dan telah terbukti dalam berbagai
penelitian transplantasi stem cell hematopoietik
selama beberapa dekade, yang menandai keberadaan
HSC. 39,40
Jumlah sel darah matur yang dihasilkan pada
manusia yaitu 1 juta sel per detik. HSC jarang
masuk ke dalam siklus sel atau berada dalam fase
G0 dari siklus sel. Bagaimana keseimbangan jumlah
HSC dapat dipertahankan selama kehidupan
seseorang dengan kebutuhan pergantian sel darah
matur, yang sebagian besar hanya hidup dalam
waktu singkat ? Keseimbangan ini amat penting
sebab gangguan perkembangan HSC dapat
memicu penyakit yang serius, misalnya
diferensiasi HSC menjadi committed progenitor
tidak diikuti hilangnya kapasitas self-renewal, atau
progenitor derivat HSC gagal mencapai diferensiasi
penuh menjadi sel darah matur, 41 atau mengalami
progresivitas menjadi preleukemia. 42
Hematopoietic stem cell dapat berada dalam kondisi
quiescence sebab dipertahankan oleh signaling
TGF-ß melalui efek inhibisi terhadap proliferasi
tanpa induksi apoptosis dari hasil studi in vitro.
43,44,45 Hal ini terbukti dari embrio mencit yang
mengalami kematian saat dilakukan knockout
signaling Smad dan TGF-ß. Namun hal ini sulit
dibuktikan TGF-ß secara in vivo. 2 Ang-1/Tie2
yaitu reseptor tyrosine kinase yang diekspreiskan
pada sel endotel dan HSC. 46,47,48 Tie dibutuhkan
untuk mempertahankan pool HSC di dalam sumsum
tulang dewasa.49 HSC yang mengekspresikan Tie2
berada dalam kondisi quiescent dan berdampingan
dengan osteoblast sumsum tulang yang
mengekspreiskan Ang-1. Pengobatan Ang-1
menekan proliferasi HSC dan mempertahankan
aktivitas repopulasi jangka panjang secara in vivo. 50
Hal ini menunjukkan bahwa Ang-1/Tie2 merupakan
target dari modifikasi HSC dalam kondisi quiescent.
4. Stem Cell Differensiasi
92
Gambar 1. Regulasi perkembangan hematopoiesis (A). hematopoiesis pertama kali terjadi pada yolk sac (YS) kemudian
pada regio aorta-gonad mesonephros (AGM), plasenta dan hati fetus (HF) Pulo darah YS dilihat memakai
pewarnaan LacZ dari embrio transgenic dengan ekspresi GATA-1. AGM dan HF diwarnai dengan LAcZ pada mencit
dengan knockin Runx1-Laz. (V) hematopoiesis pada masing-masing tempat mendukung produksi garis turunan darah
yang spesifik. ECs, endothelial cells; RBCs, red blood cells; LTHSC, long-term hematopoietic stem cell; ST-HSC, short-
term hematopoietic stemcell;CMP,common myeloid progenitor; CLP, common lymphoid progenitor;
MEP,megakaryocyte/erythroid progenitor; GMP, granulocyte/macrophage progenitor. (C) Waktu perkembangan dari
pergeseran tempat hematopoiesis.
Gambar 2. Model penentuan lineage pada hierarki hematopoietik mencit dan manusia. Sel terdiferensiasi terminal
ditunjukkan di sebelah kanan, dan hubungan lineage ditunjukkan dengan tanda panah. Pada mencit (A) HSC dipisahkan
atas kelas long-term (LT), intermediate-term (IT) dan short-term (ST) berdasar durasi repopulasi. Pada manusia (B),
HSC didefinisikan sebagai CD49f dan marker lain, tetapi belum diteliti heteregenisitas. Pada mencit, diferensiasi HSC
menghasilkan multiopoten progenitor (MPP), dan beberapa lymphoid-biased progenitor (seperti LMPP) imatur yang
mengalami spesifikasi limfoid. Pada manusia. MPP dapat diidentifikasi dengan hilangnya ekspresi CD49f. Baik mencit
maupun manusia memiliki myelo-erythorid progenitor : CMP, GMP dan MEP. Lin : cocktail yang mengandung
populasi myelo-erythroid progenitor untuk semua populasi diferensiasi terminal (sel B, sel T, NK, sel dendritik, monosit,
granulosit, megakariosit, dan eritrosit).
REGULASI EPIGENETIK TERHADAP
KESEIMBANGAN SELF-RENEWAL DAN
DIFERENSIASI PADA HEMATOPOIETIC
STEM CELL
Conrad H. Waddington tahun 1940 an
mengilustrasikan bahwa sel yang telah mengalami
diferensiasi bagaikan sebuah bola yang sedang
mengelinding di lembah; sekali masuk ke akhir
lembah, tidak mudah menyilang ke lembah yang lain
atau kembali ke posisi di puncak. Mekanisme
epigenetik yang melibatkan metilasi DNA dan
modifikasi histon secara progresif membatasi
potensi lineage (Gambar 3). 51,52 Pengetahuan
mengenai landskap epigenetik yang mengatur
perkembangan normal dari berbagai tipe sel
dipaparkan dalam studi Cui et al., yang melakukan
penelitian terhadap hematopoietic stem cell CD133+
dan CD34+ stem cells. 53
Gambar 3. Lanskap epigenetic klasik Waddington.
Conrad Waddington mengusulkan konsep lanskap
epigenetik untuk menggambarkan proses diferensiasi
sel selama perkembangan. Pada berbagai metafor
dinamik tersebut, sel (digambarkan sebagai sebuah
bola) yang sedang mengelinding, menentukan outcome
atau nasib sel.
Kelompok peneliti Cui et al., mendapatkan bahwa
diferensiasi sel CD133+ menjadi sel CD36+
(precursor eritrosit atau eritroblast) diikuti oleh
perubahan modifikasi histon pada regio genetik yang
kritikal berdasar high-resolution genome-wide
maps. H3K4me1, H3K9me1, and H3K27me1
berasosiasi dengan enhancer diferensiasi gen
sebelum aktivasi dan berkorelasi dengan ekspresi
basal, menunjukkan bahwa monometilasi ini terlibat
dalam mempertahankan potensi aktivasi sebelum
diferensiasi. H3K27me3 dan H3K9me3 merupakan
represi gen tetapi berhubungan dengan silencing
pada berbagai subset gen. Dari data yang diperoleh,
bahwa beberapa fraksi kecil gen bivalen di dalam
HSC/HSP (hematopoietic progenitor cell) tidak
memiliki H3K9me3. Assosiasi peningkatan level
H3K4me1, H3K9me3, H2A.Z (histon varian) dan
RNA polymerase II (Pol II) dengan gen bivalen
menunjukkan potensi kehilangan H3K27me3 dan
menjadi aktif selama diferensiasi. Hasil ini
menunjukkan bahwa modifikasi bivalen selama
diferensiasi telah diprogram pada stadium
HSC/HSP, dan perubahan ekspresi gen ini
mengidentifikasi manfaat enhancer dan promoter. 53
Secara ringkas penemuan hasil studi Cui tentang
regulasi epigenetik terhadap diferensiasi yaitu
sebagai berikut : pola modifikasi kromatin global
yaitu sama dan berkorelasi dengan ekspresi gen
pada dua keadaan sel, misalnya korelasi positif
antara ekspresi gen dengan H3K4me3, H3K4me1,
H3K9me1, H3K36me3, dan H4K20me1 pada
regio promoter dan genes bodies. Perubahan
epigenetik di dalam lokus pengaturan berkorelasi
dengan perubahan selama diferensiasi eritroid
yaitu dari CD133+/CD34+, berarti epigenetik
membatasi lineage. Eritroblast yang telah
berdiferensiasi mencapai silencing dalam
pemeriksaan genome-wide dengan menghentikan
H3K4me3 mark dalam 53% bivalent genes yang
dideteksi pada HSC/progenitor cells (Gambar 4).
52, 53
Jadi, studi Cui et al., mendukung efek kombinasi
modifikasi histon dalam aktivitas gen dan
membuktikan gambaran korelasi umum selama
terjadi diferensiasi sel. 53 Namun, aturan umum ini
tidak berlaku bagi seluruh kondisi, misalnya CD36
yang diekspresikan dalam kondisi aktif memiliki
H3K9me3 yang bersifat represif pada promoter.
Mayoritas gen bivalen pada HSC/progenitor cell
memiliki monovalent H3K4me3 yang diaktivasi
di dalam eritroblast, dengan hampir 10% (53 gen)
menunjukkan berkurangnya ekspresi gen. Dengan
demikian, kelihatan bahwa kode epigenetik lebih
kompleks daripada kode genetik. 52
Untuk mendapatkan pemahaman terhadap studi yang
dilakukan Cui et al., tentang diferensiasi sel CD133+
menjadi sel CD36 sebagai prekursor eritrosit
(eritroblast), maka dapat dilihat Gambar 5. 53 Sel
Stem Cell Epigenetik
95
CD34+ dan CD133+ pada sumsum tulang manusia
atau darah perifer mempertahankan hemapotopiesis
jangka panjang setelah transplantasi. 54,55 Sel ini
dapat berdirensiasi menjadi tipe sel khusus pada
studi in vitro dengan kondisi medium yang sesuai.
Jalur diferensiasi in vitro dari sel CD34+ atau
CD133+ yaitu memproduksi sel prekursor eritrosit
yang selanjutnya diinduksi menjadi sel darah merah
matur. 56Populasi stem cell yang diisolasi dari
manusia, termasuk HSC CD34+ atau CD133+
yaitu kompleks dan tersusun atas sel progenitor
dengan potensi diferensiasi yang berbeda.
Gambar 4. Kombinasi modifikasi epigenetik berkorelasi dengan status gen. Gen aktif sering berasosiasi dengan H2A.Z,
RNA Poli II, dan modifikasi histon multipel (kiri bawah). Gen represif sering ditandai dengan H3K27me2, H3K27me3,
H3K9me2, dan H3K9me3 (kanan bawah). Poised gene (tengah) ditandai bivalen H3K4me3 dan H3K27me3 pada
HSC/progenitor cell yang siap mengalami tiga kondisi perubahan selama diferensiasi eritroid; aktivasi gen (kiri atas),
mempertahankan bivalensi, dan represi gen (kanan atas). Gen bivalen yang diaktivasi di dalam eritroblast (19%) lebih
berasosiasi dengan H2A.Z, Pol lI, H3K4me1, H3K9me1 dan H4K20me1 di dalam HSC/progenitor cell. sebab itu, nasib
gen bivalen dapat diprogram bergantung pada penambahan mark modifikasi yang ada di dalam HSC/progenitor cell.
H3K4me1, H3K27me1, dan H3K9me1 dapat menggambarkan mekanisme lain dalam aktivasi HSC/progenitor cell.
Gambar 5. Diferensiasi sel CD133+ menjadi CD36+. (A) Marker permukaan sel pada sel CD133+ dan CD36+. Sel ini
diwarnai memakai antibodi spesifik yang ditunjukkan pada kolum kiri dan dianalisis dengan flow cytometry. Fraksi
sel ditunjukkan dengan pewarnaan positif untuk masing-masing antibodi. (B) Skema eksperimen. (C) Distribusi genome-
wide pada modifikasi berbeda. Jumlah total island di dalam regio promoter, gene body dan intergenik diidentifikasi untuk
masing-masing modifikasi. Grafik menunjukkan fraksi island pada setiap regio untuk masing-masing modifikasi sel di
dalam sel CD133+ dan CD36+.
HSC manusia terdiri dari ekspresi CD34 dan CD133
yang tinggi, dengan level intermediate CD117 (c-
kit) dan CD90 (Thy-1) dan tidak ada atau level
rendah dari CD38, HLADR, dan CD71. 57 Ekspresi
CD34 dan CD133 lebih dari 98% dan ekspresi
CD117 dan CD90 dalam fraksi kecil (2-20%),
sehingga jumlah ini sesuai dengan stem cell atau
progenitor cell (Gambar 5A). 53 Namun, lebih dari
99% sel ini yaitu CD38, HLA-DR dan CD71
positif, menunjukkan bahwa sebagian besar sel
merupakan sel progenitor dini.
Diferensiasi sel CD133 menjadi CD36 (Gambar
5B).53 Analisis dengan FACS mengkonfirmasi
bahwa lebih dari 98% sel CD133+ mengekspresikan
CD34+ yang tinggi dan tidak terdeteksi level CD36
(Gambar 5C). 53 Setelah diferensiasi, lebih dari 95%
sel mengekspreiskan CD36 dengan hilangnya
ekspresi CD34 (Gambar 5A, dan 5C). 53 Pada waktu
yang sama, CD117 meningkat dari 2.12% di dalam
CD133+ menjadi 87.25% di dalam sel CD36+,
sedangkan CD38 dan HLA-DR menurun masing-
masing menjadi 15.96% da 17.12%, setelah
Stem Cell Epigenetik
97
diferensiasi (Gambar 5A). 53
Analisis metilasi histon seperti H3K4me1,
H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K27me1,
H3K27me3, H3K36me3, and H4K20me1) histone
varian H2A, dan RNA Poli II (RNAP II) dilakukan
memakai ChIP-Seq. Pola modifikasi histon
berbeda pada C133+ dan CD36+. H3K4me3 islands
pada regio promoter dari sel CD133+ dan CD36+
masing-masing berjumlah 65% dan 73%, sedangkan
71-76% H3K9me3 dideteksi di regio intergenik
kurang dari 1% di dalam regio promoter (Gambar
5C). 53 Modifikasi lain termasuk H3K4me1,
H3K9me1, H3K27me1, H3K36me3, and
H4K20me1 terutama dideteksi di dalam gen yang
ditranskripsi (Gambar 5D dan 5E). 53
H3K9me3 dan H3K27me3 berimplikasi terhadap
represi gen. Kedua modifikasi kromatin berhubungan
dengan ekspresi gen pada tingkat rendah, dengan
H3K27me3 berkorelasi negatif dengan gen yang
menunjukkan level ekspresi yang rendah dan
intermediate. Sebaliknya, H3K9me3 berkorelasi
negatif dengan gen yang menunjukkan level ekspresi
yang tinggi (Gambar 6). 53 Gen ini tidak berasosiasi
dengan H3K27me3, menunjukkan bahwa H3K9me3
dan H3K927me3 memodulasi ekspresi dengan subset
gen yang berbeda (Gambar 6). 53
Gambar 6. Korelasi antara modifikasi histon dengan ekspresi gen di dalam sel CD36+. Gen dikelompokkan menjadi 100
kumpulan gen (satu titik di dalam gambar) sesuai dengan level ekspresi. Level modifikasi histon di dalam regio promoter
(A) dan gene body (B) dihitung untuk 100 kumpulan gen. Sumbu y menunjukkan level modifikasi histonm dan sumbu x
menunjukkan level ekspresi.
Gambar 7. Aktivasi dan represi selama diferensiasi HSC berhubungan dengan perubahan modifikasi histon. Profil
modifikasi histon pada gen induksi (A) dan represi (B) selama diferensiasi sel CD1330+ (merah) menjadi sel CD36+
(hijau). Tag density untuk modifikasi ditunjukkan sepanjang gene bodies dan 50 kb dari gene bodies pada 5’ dan 3’.
Aktivasi dan represi gen selama diferensiasi HSC
dari sel CD133+ menjadi CD36+ meliputi profil
modifikasi kromatin pada kelompok gen yang
diinduksi dan direpresi. Profil modifikasi yang
relatif berhubungan dengan transcriptional start
sites (TSS) menunjukkan pola yang sama untuk gen
yang selalu diekspresikan antara sel CD133+ dan
CD36. Active mark meliputi H3K4me1, H3K9me1,
H3K27me1, H3K36me3 dan H4K20me1 meningkat,
sedangkan repressive mark seperti H3K27me3
menurun pada gen yang diinduksi di dalam sel
CD36+ (Gambar 7A). 53 Sebaliknya profil perubahan
berlawanan dapat diamati pada repressive genes
(Gambar 7B). 53 Level H3K4me3 dan H2A.Z
terutama ada pada regio promoter,
menunjukkan perubahan ringan sesuai dengan pola
ekspresi, sedangkan Pol II menunjukkan perubahan
signifikan pada regio promoter dan gene body sesuai
dengan pola ekspresi.
Bivalent domains pertama kali diidentifikasi sebagai
regio H3K27me yang mengandung regio H3K4me
yang lebih kecil, terletak di transcriptional start
sites.57 Ekspresi gen bivalen selama perkembangan
membuat ekspresi gen dalam kondisi poised atau
kondisi primed yang siap untuk aktivasi cepat atau
silencing stabil pada waktu diferensiasi sel
hematopoietik. 58 Protein PRC2 (Polycomb
repressive complex 2) dan trithorax group (trxG)
menandai gen promoter yang meregulasi
perkembangan dengan bivalent domains terdiri dari
modifikasi histon represif dan activasi yang saling
tumpang tindih dan mempertahankan regulator
perkembangan dalam kondisi “poised” untuk
aktivasi embryonic stem cell (ESC) (Gambar 8)
57,58,59,60,61 Pada adult stem cell, regulator
perkembangan mengatur spesifikasi lineage dengan
epigenetik dalam keadaan represif untuk
mempertahankan multipotensi. 62
Stem Cell Epigenetik
99
Gambar 8. Bivalent chromatin domains menandai gen yang penting dalam pluripotent ES cell. Protein PRC2 dan TrxG
masing-masing mengkatalisis tri-methylation histone H3 on lysine 27 (H3K27me3) dan 4 (HeK4me3). saat terjadi
diferensiasi, bivalent histone mark dapat mengalami modifikasi monovalent dengan gen dalam ‘on” or “off”. Bivalent
domain juga dapat mempertahankan lineage-commmitted cell yang baru terbentuk.
Promoter yang mengelilingi transcriptional start
sites berlaku sebagai mesin transkripsi dan tempat
RNAPII menyatu selama insiasi transkripsi. Secara
umum, dibagi atas status CpG content/metilasi DNA
dan modifikasi histon sebagai aktif, represi atau
poised (Gambar 5). 63 Gen aktif memiliki promoter
diperkaya dengan H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac,
5hmC dan yang tidak memiliki 5mc. Sebaliknya
promoter dengan gen represif yaitu H3K27me3
dan H3K9me3, dan 5 mC. Poised genes, baik dalam
kondisi aktif atau represif selama perkembangan
memiliki bivalent promoter, ditandai dengan
adanya H3K4me3 dan H3K37me3. 55
Enhancer yang berjumlah sekitar 400.000 di dalam
genom manusia berdasar analisis modifikasi
histon terletak dekat dengan transcription start site,64
memiliki panjang 200-400 bp. 55 Secara
keseluruhan, enhancer yang diperkaya pada DNAse I
hypersentivity sites dan histone acetyltransferase
memberi struktur kromatin yang aktif atau
terbuka.65 Sebagian besar enhancer diikat oleh faktor
transkripsi multipel. Kompleks mediator, koaktivator
transkripsi sering dijumpai pada enhancer. Kompleks
mediator yaitu kompleks multiprotein besar yang
diperlukan untuk merekrut RNAP II ke promoter dari
gen target yang diregulasi enhancer. 66
Enhancer dapat dibedakan dari promoter
berdasar modifikasi histon. Sama seperti
promoter, modifikasi histon dapat digunakan untuk
mengelompokkan sebagai aktif, poised, atau represif
(Gambar 9).63 Misalnya, meskipun promoter dan
enhancer sama-sama memiliki H3K27ac, enhancer
diperkaya H3K4me1, yang berlawanan dengan
H3K4me3 yang terlihat pada promoter.
Hematopoietic stem cell (HSC) dan hematopoietic
progenitor cell (HPC) berada dalam kondisi primed
untuk diferensiasi menjadi lineage multipel dengan
ekspresi bersama dengan berbagai faktor transkripsi,
faktor pertumbuan, dan reseptornya yang terlibat
didalam lineages sebelum komitmen menjadi
lineage yang spesifik. 67 Profil ekspresi gen
sebelumnya telah mengkonfirmasi adanya faktor
penting di dalam HSC. 6869,70 Meskipun HSC
menunjukkan heterogenisitas dalam ekspresi gen
antar sel individu, koekspresi dengan faktor lain
dalam satu sel tunggal telah pernah dilaporkan. 71,72
sebab itu, multipotensi HSC dan HPC dapat
dihubungkan dengan potensi ekspresi, meskipun
dalam level rendah dengan keterlibatan berbagai gen
dalam perkembangan lineage multipel. 53 Timbul
pertanyaan : Apa yang mempertahankan potensi
aktivasi dan silencing gen ini ? 53
4. Stem Cell Differensiasi
100
Gambar 9. Pengaturan epigenetik dan remodeling pada elemen pengaturan selama perkembangan. A. Poised
enhancer/promoter terutama dijumpai pada stem cell pluripoten, memiliki modifikasi kromatin epigenetik dengan
transkripsi aktif (tanda hijau) dan represif (tanda merah). Misalnya, protein TrxG dan polycomb group (PcG) masing-
masing mengkatalisis H3K4me3 dan H3K27me3, terletak pada poised promoter. Posied regulatory element biasanya
tidak memiliki 5-methylcytosine (5mC) dan 5-hydroxymethylcytosine (5hmC). Poised enhancer dapat dibedakan dari
poised promoter dengan adanya enhancer-specific mark, H3K4me, dan terikat pada kompleks Mediator chromatin oleh
CCCTC-binding factor (CTCF) pada distal poised (active) enhancer dan promoter. B. Transisi dari poised ke active
regulatory elements melibatkan hilangnya lokalisasi PcG dan demetilasi dan asetilasi H3K27. Gain H3K36me3 di dalam
gene body juga diamati dalam aktivasi gen. C. Pembentukan heterokromatin berhubungan dengan represi gen. Hal ini
dimediasi sebagian oleh hilangnya modifikasi histon represf (H3K4me1, H3K27ac, and 5hmC), pembentukan repressive
mark, seperti H3K27me3 dan 5mC, konstriksi nuklesom.
DNMT, DNA methyltransferase; HAT, histone acetyltransferase; HDAC, histone deacetylase; MBD, methyl-DNA
binding domain protein; MED, mediator complex; PcG, polycomb group complex; POL II, RNA polymerase II; TET, ten
eleven translocation dioxygenase; TF, transcription factor; TrxG, trithorax group complex.
H3K4me3 berhubungan dengan gen aktif sedangkan
H3K27me3 berhubungan dengan gen silent di dalam
CD4+ T cell. 73,74 Koeksistensi H3K4me3 dan
H3K27me3 berhubungan dengan penurunan
ekspresi gen di dalam CD4+ T cell.
73,74,75Koeksistensi kedua modifikasi kromatin
memberi mekanisme apakah aktivasi atau represi
gen dipertahankan dalam kondisi seimbang. Studi
pada ESC menunjukkan bahwa modifikasi bivalen
mempertahankan aktivasi atau silencing pada gen
diferensiasi. 57,76 Diketahui bahwa beberapa bivalent
genes dapat kehilangan H3K4me3 sedang yang lain
kehilangan H3K27me3 selama diferensiasi sel. Cui
et al., melaporkan bahwa 19% bivalent genes
kehilangan H3K27me3 dan menjadi aktif selama
diferensiasi menjadi sel CD36+ (Gambar 10).53
Sebagian besar gen ini berhubungan dengan
modifikasi H3K4me1 dan H3K9me1 pada stadium
HSC/HPC dan terikat dengan RNA Pol II,
menunjukkan bahwa modifikasi berada dalam
kondisi poised atau siap untuk aktivasi, yang
kehilangan H3K4 me3 setelah diferensiasi. Pol II
tidak dideteksi di dalam promoter. Hasil ini
menunjukkan bahwa nasib bivalent genes selama
diferensiasi diatur oleh modifikasi kromatin meliputi
monometilasi yang terjadi pada stadium HSC/HPS.53
Stem Cell Epigenetik
101
Gambar 10. Nasib bivalent genes setelah diferensiasi dihubungkan dengan pola modifikasi kromatin pada HSC/HPC.
Fraksi bivalent genes berhubungan dengan H2A.Z, H3K4me1, H3K9me1, H4K20me1, dan Pol II dan ditunjukkan
kehilangan H3K27me3 (A), kehilangan H3K4me3 (B), kehilangan kedua (C), or bivalen menetap (D) setelah
diferensiasi.
REGULASI EPIGENETIK TERHADAP
DIFERENSIASI SEL PADA EMBRYONIC
STEM CELL
Embryonic stem cell (ESC) berasal dari inner cell
mass pada embrio preimplantasi ditandai adanya
self-renewal dan diferensisasi menjadi semua tipe
sel untuk perkembangan seluruh jaringan dan organ
embrio. 76 Pada tingkat molekuler, ES cell memiliki
ekspresi faktor transkripsi Oct4, Sox2, dan Nanog,
yang termasuk gen pluripoten yang diperlukan untuk
self-renewal. 77 Pemeriksaan dengan mikroskop
elektron menunjukkan bahwa kromatin pada ES cell
lebih homogen, dan relaksasi daripada kromatin
dengan sel terdiferensiasi, yang lebih padat. 78 Studi
biokimia terhadap struktur kromatin dengan
nuclease digestion menunjukkan reduksi kondensasi
pada ES cell yang tidak terdiferensiasi. 76 Analisis
4. Stem Cell Differensiasi
102
dengan Western blot menunjukkan bahwa marker
heterokromatin H3K9me3 diperkaya pada sel
terdiferensiasi. 79 Analisis dengan genome-wide
chromatin immunoprecipitation (ChIP) on chip atau
chromatin immunoprecipitation diikuti dengan deep
sequencing (ChIP-seq) menunjukkan jumlah
heterkromatin H3K9me3 lebih tinggi pada sel
terdiferensiasi dan penurunan H3K9ac setelah
diferensiasi ES cell. 80,81 Gen pluripoten pada ES cell
yang tidak terdiferensiasi bersifat eukromatin
dengan kondisi transkripsi aktif, sebaliknya gen
yang berhubungan dengan diferensiasi yaitu
heterokromatin dengan transkripsi silent.
76Konfigurasi ulang pada struktur kromatin selama
diferensiasi ES cell dengan regio eukromatin pada
gen pluripoten mengalami transformasi menjadi
heterokromatin, dan sebaliknya, regio kromatin yang
berhubungan dengan gen diferensiasi menjadi
eukromatin kembali ke pluripoten. sebab itu, faktor
kromatin yang membawa transisi eukromatin dan
heterokromatin tampaknya memegang peranan
penting dalam self-renewal dan penentuan nasib sel
(diferensiasi sel) (Gambar 11). 76
Epigenom pluripoten stem cell sangat berbeda
dengan sel somatik. saat membandingkan pola
modifikasi histon dan metilasi DNA antara sel
terdiferensiasi dengan ESC, Hawkins et al.,
memperkirakan bahwa kurang lebih sepertiga dari
jumlah genom dalam struktur kromatin berbeda. 81
Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan ikatan
faktor transkripsi dan keadaan remodeling kromatin
selama diferensiasi. 81,82 Misalnya, sel terdiferensiasi
memiliki regio lebih besar ditandai oleh
H3K9me3 dan H3K27me3 dibandingkan dengan
ESC. 81Domain H3K9me3 dan H3K27me3 secara
signifikan lebih besar (2-3 kali lipat) dalam
fibroblast dan limfosit T dibandingkan dengan ESC,
sedangkan domain H3K36me3 sama antara ESC
dengan sel terdiferensiasi. 81,83 Domain H3K27me3
mengalami remodeled menjadi seperti ESC selama
reprogramming. 78 Hal ini menunjukkan bahwa
ekspansi domain H3K27me3 mengikuti diferensiasi
sel. 63
Bernstein et al., menunjukkan bahwa ES cell
mengandung bivalen dengan analisis chromatin
immunoprecipitation diikuti dengan deep
sequencing, 57 dan menunjukkan bahwa regio
pengaturan utama yang banyak mengandung faktor
transkripsi terlibat dalam lineage commitment yang
berhubungan dengan modifikasi kromatin aktif
H4K3me3 dan modifikasi kromatin silent
H3K27me3. 5hmC juga diidentifikasi sebagai
marker epigenetik aktif untuk kromatin bivalen.84
Bivalent domain pada gen yang diperlukan untuk
komitmen ES cell mengalami diferensiasi tetap
silenced, berisikan H3K27me3, H3K9me3, dan 5mc
metilasi DNA, yang membawa kromatin dalam
keadaan stabil (Gambar 11). 85,86,87
Bivalent domain pada ESC sering mengadakan transisi
menjadi H3K27me3 yang berekspansi menjadi lineage-
committed cell, sehingga H3K27me3 ada di dalam
genom pada 40% sel terdiferensiasi dibandingkan
dengan ESC sebanyak kurang lebih 8%.83 Diferensiasi
memicu penkayaan H3K27me3 yang terjadi pada
tipe sel yang spesifik. Represi yang dimediasi oleh
Polycomb merupakan mekanisme penting yang
menentukan nasib sel sehingga mendukung hasil
diferensiasi dengan lanskap kromatin yang semakin
dibatasi. 81,83,89 Sebagian besar bivalent domain pada
ESC yang tidak terdiferensiasi berubah menjadi status
monovalen pada sel yang menjadi lineage tertentu.82,89
Sebagai contoh, diferensiasi kardiomiosit dari ESC
memerlukan banyak faktor transkripsi kunci seperti
GATA6, GATA4, NKX2.5, HAND2, TBX5 dengan
signaling molekul (BMP2 dan WNT5a) terlibat dalam
perkembangan kehilangan H3K27me3 secara bertahap
dan peningkatan H3K4me3 sejalan dengan transkripsi
saat diferensiasi berlangsung. 90,91 Sebaliknya,
diferensiasi jantung memerlukan represi epigenetik yang
dimediasi EZH2 pada faktor transkripsi untuk maturasi
kardiomiosit.91,92 Kehilangan H3K3me2/me3 biasanya
diikuti munculnya metilasi DNA. 82
Pada embryonic stem cell (ES) cell yang tidak
terdiferensiasi, faktor kromatin yang bersifat write,
read dan erase metilasi DNA diekspresi dengan
tinggi, dengan deteksi level metilasi DNA yang
tinggi. 93,94 Pada waktu diferensiasi ES cell dengan
lineage commitment, terjadi redistribusi metilasi
DNA, yang mempengaruhi diferensiasi dan
pemeliharaan identitas tipe sel. 95,96,97,98 Perubahan
metilasi DNA terutama terjadi pada regio promoter
dengan gen stem cell yang spesifik.
Pergeseran keseimbangan antara hidroksimetilasi
dan metilasi DNA sepanjang genom dihubungkan
dengan pluripotensi dan lineage commitment. 84,96
Keseimbangan antara pluripotensi dan lineage
commitment tergantung pada aktivitas TET dan
TDG. Kedua protein bekerja berlawanan dengan
metilasi DNA de novo sehingga berkontribusi
terhadap pemeliharaan regio kromatin bivalen yang
aktif. 84,96,98,99
Stem Cell Epigenetik
103
Gambar 11. Mekanisme epigenetik yang terlibat dalam self-renewal dan diferensiasi embryonic stem (ES) cell. A,
Perubahan modifikasi epigenetik selama diferensiasi ES cell. Gen pluripotensi pada ES cell yang aktif terletak di dalam
regio kromatin ditandai dengan H3K4me3 dan H3K9ac. Gen diferensiasi ditranskripsi dalam kondisi silent dan terletak
di dalam regio heterokromatin ditandai oleh H3K9me3 dan 5mC. Konfigurasi ulang pada struktur kromatin berhubungan
dengan gen pluripotensi, ditransformasikan menjadi heterokromatin. Sebaliknya, gambaran terjadi pada regio kromatin
yang berhubungan dengan diferensiasi. Modifier kromatin yang membawa transisi eukromatin dan heterokromatin
meliputi DNA methyltransferase (DNMT); histone methyltransferase SETDB1, MLL/Wdr5 complex; histone
demethylase Jmjd1a, Jmjd2c, Kdm5b; histone acetyltransferase GCN5; dan ATP-dependent chromatin remodeling
complex CHD1, Brg1, Tip60-p400 complex. B, Bivalent chromatin domains dan kontrol epigenetik terhadap lineage
commitment. Pada sel pluripotent, gen lineage commitment berada dalam keadaan poised dan menunjukkan modifikasi
epigenetik bivalen: H3K4me3 aktif dan H3K27me3 represif. 5hmC terjadi juga pada bivalent domains. Pada lineage
commitment, gen yang mengatur cell lineage mempertahankan H3K4me3, menghilangkan H3K27me3, dan menjadi aktif.
Gen yang mengatur lineages lain mempertahankan H3K27me3, peningkatan H3K9me3 dan 5mC, dan menjadi silence.
Modifier kromatin yang mengatur bivaent chromatin domain meliputi DNA methyltransferase DNMT1; TET1; histone
methyltransferase; demethyllase complex MLL/Dpy-30, MLL/Jmjd3/UTX complex, PRC2 complex, dan LSD1.
Modifikasi histon yang banyak diteliti yaitu
metilasi H3K4 dan H3K27. Regulasi metilasi H3K4
oleh histone methytransferase dan demethylase
meliputi perubahan struktur kromatin dan bivalent
chromatin domain selama diferensiasi ES cell.
Metilasi H3K4 dikatalisir oleh trithorax group
(TrxG) MLL/set1 MLL/Set1 (myeloid/lymphoid or
mixed-lineage leukemia) complexes (MLL
complexes). MLL complexes mempertahankan gen
dalam keadaan aktif selama penentuan nasib sel.
100,101 Beberapa MLL complexes telah diidentifikasi
di dalam ES cell, yang mengandung subunit katalitik
berbeda (hSet1, MLL1, MLL2, MLL3, atau MLL5
dan beberapa subunit inti. 102 Deplesi beberapa unit
4. Stem Cell Differensiasi
104
inti dapat mengurangi level metilasi H3K4.
Hilangnya MLL1 dan MLL2 tidak mengganggu
metilasi H3K3 global dan tidak meregulasi self-
renewal pada ES cell tetapi berperan pada
koordinasi dan waktu diferensiasi. 103,104
Metilasi H3K27 dikatalisir oleh PRC2 (Polycomb
repressive complex 2), yang termasuk famili protein
PcG (Polycomb group), terlibat dalam silencing
gene atau mempertahankan silent gene dalam
kondisi “poised” sebelum aktivasi gen selama
diferensiasi EC cell. 105 Analisis genome-wide
menunjukkan bahwa beberapa protein PRC2 lebih
condong berikatan dengan silent genes yang terlibat
dalam regulasi perkembangan. Protein PRC2 tidak
penting dalam self-renewal ES cell tetapi berperan
dalam diferensiasi (Gambar 11), 76 sebab ES cell
yang kehilangan PRC2 protein Suz12 (suppressor of
zeste 12 homolog), Ezh1/Ezh2 (enhancer of zeste
homolog 1/2), and Jarid2 (Jumonji, AT-rich
interactive domain 2) masih bisa berkembang biak
dalam kondisi tidak terdiferensiasi pada kultur.
106,107,108 Demikian juga, menghilangkan H3K27me3
oleh histone demethylase Jmjd3 (Jumonji domain–
containing 3) dan UTX (ubiquitously transcribed
tetratricopeptide repeat, X chromosome) yang hanya
diperlukan untuk diferensiasi sel tetapi bukan self-
renewal, menunjukkan bahwa regulasi metilasi
H3K27 dalam regulasi ES cell bersifat dinamik.
109,110
eprogram sel dapat didefinisikan sebagai upaya
untuk menghasilkan tipe sel yang berfungsi
normal dari satu jenis sel terdiferensiasi menjadi sel
lain tanpa melewati stadium pluripotensi, 1 yang
bertujuan untuk menghasilkan sel yang diinginkan
untuk keperluan kedokteran regeneratif jangka
panjang.2 Reprogram sel melibatkan pemakaian
faktor transkripsi, regulator epigenetik, microRNA,
molekul kecil, yang bekerja secara langsung
melakukan reprogram satu sel somatik (sel yang
sudah terdiferensiasi) menjadi sel lain. 3Teknologi
ini memungkinkan untuk dilakukan sebab
melibatkan suatu networking gen aktif selama proses
perubahan yang menginduksi pergeseran landskap
epigenetik, sehingga dapat dihasilkan diferensiasi sel
yang baru. Dengan demikian, reprogramming sel
dapat ditujukan untuk mengubah sel residen di
dalam organ yang rusak untuk diregenerasikan
menjadi tipe sel secara in situ (setempat) sehingga
dapat mengembalikan fungsi organ. 3
Konsep sel terdiferensiasi bersifat plastisitas yang
dapat direprogram menjadi sel lain pertama kali
digagas dalam eksperimen kloning oleh Gurdon, 4
kemudian dilanjutkan Wilmut, 5 yang menghasilkan
seekor domba bernama Dolly. 5Dalam penelitian ini,
faktor yang belum diketahui di dalam sitoplasma
oosit menginduksi sel somatik menjadi sel
embrionik. Sel embrionik berkembang menjadi
fetus, dan akhirnya lahir satu organisme yang hidup.
Pengamatan ini merupakan cikal bakal lahirnya
reprogram sel secara in vivo. 3
Hampir tiga puluh tahun yang lalu, Davis et al.
memakai mioblast cDNA tunggal yang
menyandi faktor tranksripsi MyoD, mengubah
fibroblast secara langsung menjadi mioblast. 6
Dengan keberhasilan ini, lahir “direct
reprogramming” secara in vitro. Penemuan ini
sejalan dengan observasi bahwa reprogram
nukleus dapat mengubah fibroblast secara cepat
setelah berfusi dengan miosit. 7 Setelah itu, diteliti
berbagai jenis sel lain, namun gagal mengubah
fibroblast menjadi sel lain sebab tidak
mengekspresikan faktor transkripsi yang
menyerupai MyoD. Terakhir ditemukan C/EBPa
yang mengubah sel limfosit menjadi sel mieloid
untuk sistem hematopoietik. 8
R
5
Stem Cell Epigenetik
111
Nasib sel yang sulit diubah setelah terbentuk sel
terdiferensiasi
.jpeg)
.jpeg)
