INDUKSI IN· VITRO SEL PUNCA MESENKIM DARI TALI PUSAT
MANUSIA MENJADI SEL PUNCA LIMBAL
Saat ini berbagai jenis sel punca dewasa sedang dikembangkan untuk
dimanfaatkan sebagai salah satu sumber alternatif terapi sel, terutama pada
beberapa penyakit degeneratif. Potensi sel punca mesenkim (SPM) yang bersifat
multipoten, yaitu dapat berdiferensiasi menjadi beberapa tipe sel, seperti
osteosit, kondrosit, adiposit, dan dalam beberapa penelitian berbasis
laboratorium (in vitro maupun in vivo), SPM dapat berdiferensiasi menjadi sel
syaraf, kardiomiosit, hepatosit, dan sel islet pankreas. Sel punca mesenkim dapat
diisolasi dari berbagai jaringan dewasa, seperti sumsum tulang, darah tepi, darah
dan jel Wharton tali pusat serta membran dan cairan amnion, meskipun dalam
jumlah sel yang terbatas.
Kegiatan diawali dengan melakukan isolasi SPM dari jel Wharton tali pusat
manusia dengan metode eksplantasi cacahan dan teknik enzimatik terhadap jel
Wharton. Sel yang sudah diisolasi selanjutnya dikultur memakai medium
SPM dan dikarakterisasi dengan pemeriksaan beberapa marker positif CD90,
CD105, CD166 dan marker negatif terhadap CD34, CD45 memakai Faes
Calibur flowcytometry. Pengamatan viabilitas SPM dilakukan berdasarkan
pewarnaan trypan blue sebelum dan sesudah kultur. Hasil kultur SPM
selanjutnya diinduksi kearah sel punca limbal (SPL) dengan menambahkan
conditioned medium pada medium kultur epitel.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa isolasi SPM dapat dilakukan
dengan teknik eksplantasi maupun enzimatik dari jel Wharton tali pusat. lnduksi
SPM kearah SPL dapat diaku!<an dengan modifikasi medium kultur dan �
penambahan conditioned medium. Hasil induksi dapat diamati secara
imunohistologi dan imunositologi sedikitnya sesudah 4 minggu, dan diharapkan
akan terbukti memiliki karakteristik yang serupa dengan hasil kultivasi SPL
yang original.
Tujuan: Kerusakan kornea akibat defisiensi sel punca limbal (SPL) dapat
direhabilitasi dengan memakai allograft SPL. Penelitian ini mencoba untuk
menginduksi SPL in-vitro dengan menginduksi sel punca mesenkim (SPM), yang
diisolasi dari jel Wharton dari tali pusat manusia.
Metode: Sel punca mesenkim dapat diisolasi dari jel Wharton, dengan metode
eksplan atau enzimatik. Karakterisasi SPM dan SPL memakai flowcytomeffY
Faes Calibur dan imunohistokimia. Mikroskop memvisualisasikan beberapa
morfologi sel. Viabilitas sel dideteksi dengan pewamaan trypan blue.
Hasil: MSC dapat diisolasi dari Wharton jelly dari tali pusar manusia oleh
explantation dan metode enzimatik. Kedua metode menghasilkan populasi sel
dengan morfologi yang heterogen. Hasil kultur fibroblas limbal menunjukkan
populasi sel homogen yang berbentuk spindle dan menjadi konfluens dalam
waktu 13-16 hari. Conditioned medium fibroblas limbal merupakan niche yang
tepat untuk menginduksi SPM menjadi SPL.
Kesimpulan: Sel punca mesenkim yang berasal dari Wharton jelly diperkirakan
dapat diinduksi secara in vitro, mengarah pada SPL. Percobaan lebih lanjut untuk
mengembangkan metode kultur ekspansl sel dan uji pra-klinis (percobaan hewan
xenotransp/antation model) diperlukan.
pemicu kerusakan kornea bermacam-macam, antara lain defisiensi sel punca limbal
(DSPL), infeksi dan inflamasi, terrnasuk trakoma dan ulkus kornea; xeroftalmia, kelainan
genetik, trauma mekanis, termal, atau kimiawi; · atau reaksi alergi berat, misalnya
sindrom Stevens Johnson (SSJ). Pada SSJ yang berat dapat terjadi kerusakan total
bagian permukaan mata, termasuk kerusakan epitel komea yang berat, DSPL parsial
atau total, dan terbentuknya parut kornea. Selain disebabkan oleh SSJ, DSPL dapat
terjadi karena trauma termal atau kimiawi, radiasi pengion dan ultraviolet (UV). krioterapi
atau operasi berulang, pemakaian lensa kontak, infeksi mikroba yang luas, pemfigoid
sikatrik, dan aniridia, tetapi kadang-kadang idiopatik. lnsiden DSPL sampai saat ini tidak
diketahui secara pasti
Pada keadaan DSPL, epitel konjungtiva bermigrasi ke komea, atau dikenal dengan
proses konjungtivalisasi. Konjungtivalisasi mengakibatkan permukaan komea menebal,
iregular, dan tidak stabil, sehingga mudah terjadi kerusakan, ulserasi, parut komea,
vaskularisasi, dan kekeruhan komea, bahkan gangguan penglihatan dan kebutaan.
Penderita umumnya menunjukkan gejala peradangan berat dan kronis, mata terasa
tidak nyaman, fotofobia, mata berair, blefarospasme, serta penurunan visus.
Pada DSPL totalldifus, konjungtivalisasi dapat menghalangi axis visual, bahkan sampai
menutupi semua bagian komea, sedangkan DSPL parsial/lokal umumnya masih disertai
bagian komea yang normal karena sebagian daerah limbus masih sehat dan sel punca
limbal (SPL) masih dapat menunjang proses regenerasi epitel komea. Terapi kasus
DSPL total akan berhasil jika populasi SPL diperbarui dengan melakukan empat tahap
prosedur, yaitu transplantasi otologus konjungtiva-limbal; transplantasi allogenik
konjungtiva-limbal, transplantasi allogenik kerato-limbal; dan transplantasi SPL yang
sudah diekspansi secara ex-vivo
Transplantasi komea allograft seringkali mengalami kegagalan karena reaksi penolakan
imunologis. Transplantasi komea reiatif jarang dilakukan di Indonesia karena sangat
terbatasnya jumlah donor komea yang tersedia tiap tahunnya, sedangkan jumlah calon
penerima donor cenderung bertambah. Transplantasi SPL autograft sering dilakukan
terutama pada kasus avulsi pterygium dengan sebagian besar daerah limbus masih
nonnal. Pada kasus DSPL total bilateral per!u donor SPL dari individu yang masih ada
kekerabatan sedarah untuk mengurangi kemungkinan imunorejeksi. Keterbatasan
sumber donor SPL sedarah menjadi salah satu alasan penelitian ini dilakukan, sehingga
diharapkan dari penelitian ini akan didapatkan alternatif sumber donor SPL dari cell-line
non limbal, khususnya set punca mesenkim (SPM) yang diisolasi dari tali pusat,
pengambilan spesimen tidak invasif, meskipun altematif ini masih merupakan sumber
donor allogenik. Troyer dan Weiss menyimpulkan. bahwa tidak dapat dibuktikan adanya
imunorejeksi pada penggunaan SPM dari jet Wharton secara in-vivo dan dapat
ditoleransi dengan baik pada transplantasi aflogenik (Troyer dan Weiss, 2008).
Pemilihan tali pusat sebagai sumber SPM berdasarkan beberapa pertimbangan, yaitu
bahwa SPM fetal tidak memicu konflik terkait masalah etika; memiliki kapasitas ekspansi
in-vitro lebih besar dalam waktu lebih singkat yang mungkin berhubungan dengan
telomer yang lebih panjang; tampaknya kurang memiliki sifat imunosupresi; kurang
memiliki class II human leukocyte antigens (HLA), tetapi memiliki HLA-G;
mengekspresi sitokin yang sedikit berbeda; dibandingkan dengan SPM dewasa
Publikasi nasional dan internasional tentang induksi SPM kearah SPL masih sulit
ditemukan secara on-line. Meskipun demikian plastisitas SPM yang luas memungkinkan
penelitian ini dilaksanakan dan selanjutnya dapat
dikembangkan sampai batas yang belum diketahui dengan melakukan modifikasi pada
komposisi medium kultur, variasi suhu, jenis matriks (sebagai scaffold), maupun variasi
lamanya pengamatan Sepanjang pengetahuan
peneliti, studi ini merupakan studi pertama yang bermaksud menginduksi SPM dari tali
pusat yang bersifat multipoten menjadi SPL yang bersifat oligopoten, sehingga banyak
hat yang perlu dieksplorasi untuk m�ndapatkan pemahaman lebih baik tentang induksi
SPL dan untuk mengembangkan teknik serta metode eksperimen in-vitro terkait,
sebelum diaplikasikan pada manusia. Ahmad dkk berhasil menginduksi set punca
embrionik manusia (SPE) komersial, menjadi epitel kornea dengan membuat tiruan
niche SPL pada kultur in-vitro dan menambahkan komponen matriks ekstraselular untuk
coating, yaitu kolagen-IV, atau laminin, atau fibronektin, pada wadah kultur jaringan
tempat menumbuhkan SPE yang akan diinduksi
Penelitian eksperimental in vitro ini diharapkan dapat menghasilkan sebuah prosedur
teknik induksi SPM yang diisolasi dari jel Wharton
tali pusat manusia, menjadi SPL. Selain spesimen jet Wharton, akan diambil juga
membran amnion dari plasenta bayi (responden) untuk dipersiapkan sebagai matriks
saat dilakukan ekspansi epitel limbal pada penelitian selanjutnya. Dipilih spesimen
bersumber tali pusat sebagai sumber SPM karena meskipun relatif lebih rendah
keberhasilan isolasi SPM-nya jika dibandingkan isolasi SPM dari sum-sum tulang dan
jaringan adiposit, tetapi prosedur pengambilan spesimen dari tali pusat relatif tidak
invasif dan hanya memanfaatkan spesimen tali pusat yang umumnya akan dibuang
sesudah plasenta lahir pada proses persalinan.
Permukaan mata ditutupi oleh dua lapisan sel yang berbeda, yaitu lapisan epi1el komea
dan lapisan epitel konjungtiva yang menutupi permukaan sklera. Kedua lapisan epitel ini
dipisahkan oleh zona transisional yang disebut daerah limbus, yang berbentuk sirkular
sesuai lingkaran luar komea. Epitel komea diperbarui setiap 3-10 hari oleh kumpulan
SPL . Jika terjadi kerusakan
SPL total, maka epitel limbal tidak terbentuk dan epitel komea juga tidak terbarui dengan
optimal, sehingga fungsi epitel komea lambat laun akan terganggu. Kerusakan SPL
akan memicu epitel konjungtiva tumbuh kearah komea (konjungtivalisasi).
Konjungtiva merupakan membran mukoid yang melapisi seluruh permukaan dan bagian
dalam palpebra superior dan inferior mata, kecuali daerah komea. Konjungtiva dilapisi
epitel skuamosa non keratinisasi, namun pertumbuhan epitelnya tidak bergantung pada
ada tidaknya SPL. Epitel konjungtiva bagian apikal memiliki banyak vesikel dalam
sitoplasmanya. Vesikel ini mungkin terbentuk karena proses fagositosis atau eksositosis
. • Fungsi utama konjungtiva yaitu sebagai penyedia
tear film dan dilengkapi dengan zat bakterisida dan virusida untuk melindungi
pennukaan mata terhadap infeksi
Umbus dihuni oleh satu lapis sel basal limbal yang bergelombang, 7-10 lapis sel
skuamosa bertingkat non-keratinisasi yang membentuk epitel limbal, melanosit dan sel
Langerhans yang sering tampak diantara sel epitel, serta jaringan penunjang longgar
dengan jaringan vaskular sebagai sumber nutrien bagi semua sel diatasnya. Sel apikal
epitel limbal memiliki mikroplika/mikrovilli pada membran apikal. Bagian basal sel
basal limbal sebagian tertutup hemidesmosom. Set basal berbentuk kolumnar yang
berukuran sedikit lebih kecil dibandingkan sel basal komea. Sekitar 5-15% sel basal
limbal yaitu SPL, yang berada ter1indung dalam kripti pada Palisade Vogt
Thoft dkk (1 983) mengajukan hipotesis 'The X, Y, Z of corneal epithelial maintenance'
yang menyatakan bahwa penjumlahan proliferasi sel basal (X) dan sel yang bermigrasi
sentripetal (Y) yaitu sama dengan sel epitel permukaan kornea yang hilang, tetapi
Theft dkk tidak dapat menjelaskan bagaimana ketertibatan sel konjungtiva bulbar.
Tahun 1989, Sharma dan Coles melaporkan bahwa analisis matematis menunjukkan
massa sel epitel komea semata-mata diperbarui oleh SPL.
Seperti sel punca lainnya, SPL juga memiliki karakteristik antara lain: menjadi
prekursor yang dapat membentuk sel lain; pembelahan asimetri (satu sel anak transient
amplifying cellslf AC yang akhimya berdiferensiasi dan satu sel anak yang tetap menjadi
sel punca) untuk self-maintaining populasi SPL (Gambar 2); merupakan bagian kecil dari
seluruh populasi sel di daerah limbus; tidak atau lebih lambat berdiferensiasi dibanding
sel lain di jaringan yang sama; slow-cycling in-vivo, tetapi mudah dikloning pada kultur
sel
Gambar 2. llustrasi pembelahan aslmetris sel punca yang dikontrol niche17
Eksperimen pertama tentang indikasi adanya sel punca komea di limbus dilakukan oleh
Mann (1944) yang mengobservasi pergerakan pigmen (melanin) dari limbus menuju
defek pada epitel komea kelinci. Dav.anger dan Evenson (1971) juga mencatat migrasi
sentripetal pigmen dari limbus menuju komea sentral manusia dan menduga bahwa
Palisade Vogt (PV) yaitu sumber SPL. Huang and Tseng (1991) melaporkan bahwa
pengangkatan total limbus menyebabkan fungsi kornea terganggu, neovaskularisasi,
dan konjungtivalisasi.17
Sel punca mungkin dapat dikenali dengan labelisasi DNA karena slow cycling dan hanya
membelah sesekali (Bickenbach, 1981). Dengan asumsi pelabelan dilakukan saat terjadi
pembelahan dengan label prekursor DNA seperti tritiated thymidine atau
bromodeoxyuridine (BrdU) yang diikuti chase period 8 minggu, maka sel punca akan
ditemukan dalam keadaan terlabel. Cotsarelis et al (1989) menemukan sel dengan
retensi label seperti itu pada 10% sel basal limbal. Populasi sel terse but tampaknya lebih
primitif karena bentuknya tetap kecil dan bulat
Gambar 3. Skema arah pergerakan dan perubahan sel punca limbal menuju komea 11
Kornea terdiri dari 5 lapisan dari luar keclalam, yaitu epitel yang terdiri dari 3 jenis sel;
membran Bowman, stroma, membran Descemet, dan endotel. Epitel komea terdiri dari
3-4 lapis sel skuamosa datar non-keratinisasi, 1-3 lapisan sel suprabasaVwing, dan satu
lapis sel basal berbentuk kolumnar dan mengalami mitosis (Smolin dan Thoft, 2004).
Secara embriologis, epitel komea terbentuk dari permukaan lapisan e'ktoderma,
, sedangkan stroma komea dan endotel berasal dari mesenkim (
Kornea memiliki 4 fungsi utama, yaitu melindungi hilangnya cairan dari dalam bola
mata; sebagai sawar terhadap patogen; menahan tekanan yang dapat menimbulkan
abrasi; dan mencegah kontak bagian intraokular dengan udara luar. Jika terjadi Iuka
pada komea, sel epitel komea akan berusaha menutup per1ukaan sesegera mungkin.
Gambar 4. Potongan lintang komea manusia 17
Epitel komea mengekspresi berbagai macam sitokeratin/keratin yang diberi simbol K.
Semua sel komea mengekspresikan K3 dan K12, sedangkan sel basal komea
mengekspresi KS dan K14. Ekspresi K12, 64kD yaitu protein spesifik komea. Semua
sitokeratin ini tidak ditemukan di SPL, begitu pula koneksin (Cx43) yang hanya
ditemukan di kornea dan konjungtiva. Stroma komea mengandung banyak protein, yang
dikelompokkan dalam 3 kelompok besar, yaitu kolagen, proteoglikan, dan glikoprotein.
Proteoglikan spesifik untuk komea yaitu keratokan {Smolin dan Thoft, 2004) dan tidak
ditemukan pada SPL. Gen PAX6, AC133, K12, dan OCT4 didapatkan pada jaringan
konjungtiva, komea, maupun limbal.
Komponen membran basal komea berbeda dengan limbal. Daerah limbal mengandung
laminin-1,5 dan rantai a2J32, kolagen tipe IV, rantai a1, a2 dan a5, sedangkan di komea
ditemukan rantai a3 dan a5 menemukan bahwa immunolokalisasi laminin rantai y3 yang
konstan, BM40/SPARC dan tenancin C, yang juga ditemukan co-localise dengan klaster
sel ABCG2/p63/K19-positive. Faktor-faktor ini mungkin ter1ibat dalam memelihara
potensi cell sternness (Schlotzer-Schrehardt dkk, 2007).
Niche limbal bersif at vascular dengan inervasi yang ban yak (Lawrenson and
Ruskell, 1991), sehingga merupakan sumber nutrien dan growth factors untuk SPL, tidak
seperti .kornea yang avaskular. Fibroblas pada stroma limbal heterogen dand
mengekspresi secreted protein acidic and rich of cysteine (SPARC) yang mungkin
berperan untuk adhesi SPL Nakamura dkk mengidentifikasi
populasi sel-sel turunan sumsum tulang yang ber1okasi pada stroma limbal sesudah
dilakukannya transplantasi GFP labelled bone marrow cells pada nude mice (Nakamura
dkk, 2005). Sel-sel ini mungkin saja bermigrasi ke stroma limbal, meskipun fungsi
migrasinya masih belum diketahui.
Sel punca yaitu sel khusus yang memiliki potensi membelah diri dalam waktu yang
tidak terbatas dan dapat menghasilkan berbagai jenis sel spesifik. Kemampuan ini
dikenal sebagai daya plastisitas, seperti halnya set embrionik fase awal (blastomer).
Secara garis besar sel punca dapat berasal dari embrio atau disebut SPE atau dari
fetus, jaringan/organ dewasa dan disebut sel punca dewasa (SPD) . Sel punca embrionik
merupakan sel pluripoten (mampu berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel) yang
sangat prospektif untuk terapi berbasis set dimasa mendatang. Namun demikian
pemanfaatan SPE manusia masih ter'kendala berbagai masalah terkait isu etika karena
berasal dari embrio yang merupakan hasil fertilisasi sel telur oleh spermatozoa. Sel
punca dewasa yang umum digunakan secara klinis yaitu sel punca hematopoietik
{SPH) dan SPM yang dapat diisolasi dari berbagai jaringan dewasa
Sel punca mesenkim yaitu sel somatik yang dapat diisolasi dari berbagai jaringan
dewasa, memiliki kemampuan memperbarui diri sampai jumlah yang cukup untuk
penyembuhan Iuka atau mengganti�an jaringan yang sakit. Karakteristik in vftro SPM
yang terpenting yaitu kemampuan proliferasi, berkembang dan membelah diri
dalam waktu yang tak terbatas dengan fenotipe embrionik (belum berdiferensiasi).
Yang dimaksud fenotipe embrionik meliputi ukuran atau morfotogi yang sederhana;
perilakunya dalam berinteraksi dan metode melakukan komunikasi dengan set-sel lain;
serta komposisi glycoca/yx yang menutupi permukaan semua sel dan bervariasi sesuai
dengan tahap perkembangan sel punca. The Mesenchymal and Tissue Stem Cell
Committee of The lntemational Society for Cellular Therapy menetapkan konsensus
tentang kriteria SPM, yaitu setidaknya melekat pada permukaan plastik biakan pada
keadaan kultur standar; mengekspresi marker CD105, CD73, dan CD90, tidak
mengekspresi CD45, CD34, CD14 atau CD11b, CD79a atau CD19 dan molekul
permukaan HLA-DR; dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas, kondroblas, dan adiposis
pada eksperimen in v itro.
Beberapa penelitian terdahulu telah membuktikan bahwa SPM memiliki potensi
transdiferensiasi karena dapat diinduksi terarah menjadi derivat endodenna (endotel
vaskular), mesodenna (osteoblas, kondroblas, kardiomiosit (Ginard & Ferrer, 2006), set
islet pankreas , serta ektodenna
(mikroglia, sel mirip neuron, dan epitel komea). Penelitian oleh Gu dkk merupakan
penelitian dengan memakai hewan coba k.elinci yang melaporkan bahwa SPM yang
diisolasi dari sumsum tulang dapat diarahkan menjadi epitel komea dengan bukti
ditemukannya CK3 pada set epitel komea hasil induksi yang dilakukan ko-kultur dengan
SPL, yang diperiksa pada hari pertama sampai ketiga. Ahmad dkk juga telah berhasil
membuat replika niche SPL untuk menginduksi SPE menjadi epitel komea. Telah
diketahui bahwa niche berperan sangat penting dalam upaya memelihara set punca, dan
hal ini juga berlaku bagi SPL. Komponen matriks ekstraselular kolagen tipe IV sebagai
unsur penting dalam niche SPL telah terbukti dapat mengarahkan SPE menjadi epitel
kornea, seperti laporan penelitian Ahmad dkk, 2007. Pada penelitian ini metode kultur
untuk mendapatkan SPL akan memakai metode Ahmad dkk, dengan mengganti
SPE dengan SPM yang diisolasi dari tali pusat. lnduksi akan dihentikan jika telah
didapatkan marker p63+/K12"/ABCG2+ dengan observasi minimal selama 3 minggu dan
SPL yang dihasilkan akan dipertahankan agar tidak berdiferensiasi menjadi epitel
komea.
Beberapa penelitian terdahulu telah membuktikan bahwa SPM turunan sumsum tulang
dapat diinduksi terarah menjadi derivat ketiga lapisan germinal atau transdiferensiasi
(Lee, 2004; Liu, 2007). Derivat endoderma yang dapat dihasilkan dari indulksi SPM
yaitu endotel vaskular; derivat mesoderma meliputi osteosit, kondrosit, adiposit,
kardiomiosit. sel islet pankreas, hepatosit, dan hematosit; sedangkan derivat ektoderma
yang telah dilaporkan antara lain sel mirip neuron dan epitet kornea pada kelinci. Gu dkk
melaporkan bahwa SPM dari sumsum tulang kelinci terbukti berdiferensiasi menuju sel
komea secara in-vivo, tetapi secara in-vitro baru diketahui bahwa marker CK3 yang
spesifik untuk kornea dapat diisolasi dari kultur SPM turunan sumsum tulang ini
TUJUAN UMUM
Menghasilkan SPL secara in-vitro dari induksi SPM yang diisolasi dari jel Wharton
tali pusat manusia.
1. Membuat preparasi spesimen dari tali pusat, khususnya dari jel Wharton.
2. Mampu melakukan isolasi dan kultur SPM dari spesimen jel Wharton tali pusat.
3. Memperoleh karakteristik SPM dan dapat mengidentifikasi antigen permukaan
khas SPM pada hasil isolasi yang berupa adherent fibroblastic../ike cells secara
mikroskopis, SH3(+}/petanda integrin, CD90(+)/,CD1 05(+)/molekul adesi, CD34(-)
/petanda antigen hematopoeitik).
}
4. Mengembangkan prosedur kultur spesifik untuk diferensiasi SPM menjadi SPL
secara in-vitro sesuai prosedur Ahmad dkk (2007) dengan membuat tiruan niche
SPL memakai SPL kadaver.
5. Mengidentifikasi petanda/marker SPL, yaitu p63(+), K12 64kD (-),Nodal (-), dan
ABCG2+ dari hasil induksi SPM tali pusat.
MANFAAT
1 . Mendapatkan metode baru kuttur spesifik untuk diferensiasi SPM menjadi SPL
secara in-vitro.
2. Menyumbangkan informasi terbaru bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
3. Memberikan altematif sumber donor SPL untuk kasus DSPL dengan
konjungtivalisasi luas, yang dikembangkan dari SPM agar dapat dilakukan
restorasi dan rehabilitasi visus
·
pasca transplantasi SPL.
JV. HIPOTESIS
SPL yang dikembangkan dari SPM tali pusat manusia memiliki karakteristik
serupa dengan SPL original yang diisolasi dart daerah limbus.
9
V. METODA PENELITIAN
V.1. ALUR PENELITIAN
Spesimen dari jel
Wharton tali pusat
manusia
Mononuclear cells SPM rnanusia (milcroskopis & flow-cytometri)
Spontan
Multiple lineage lnduksl In vitro
Sel punca llmbal (SPL)�mikroskopis &
imunohlstokimia
V .2. Tempat Penelitian
• lsolasi, pasase, karakterisasi, dan identifikasi SPM manusia dilakukan di
laboratorium sel punca, Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan
(memakai SOP BSL2+).
• Pengembangan dan optimasi kultur spesifik untuk induksi diferensiasi SPM menjadi
SPL secara in-vitro dilakukan di laboratorium sel punca, Pusat Biomedis dan
Teknologi Dasar Kesehatan serta di FKH-IPB (memakai SOP BSL2+).
V.3. Waktu Pelaksanaan: Tahap I Maret 2012 - Desember 2012 (10 bulan).
V .4. Desain Penelitian
Penelitian merupakan penelitian eksperimental berbasis laboratorium.
V.5. Sampel
Sel punca mesenkim manusia yang diisolasi dari jel Wharton tali pusat bayi baru lahir di
RSCM sesuai kebutuhan eksperimen, sampai berhasil didapatkan SPL secara in vitro.
Spesimen daerah limbus dan kornea (<24 jam pos-mortem) yang tampak normal secara
makroskopik.
V.6. Variabel
Vanabel independen: komposisi medium, modifikasi matriks, temperatur, dan lama
pengamatan.
Variabel dependen: SPL in vitro (marker p63+/ K12-1Nodar/ABCG2•).
10
V.7. Cara Pengumpulan Data
Data pengamatan hasil intervensi/eksperimen dan setiap langkah eksperimen dicatat
dan dilampirkan dalam log book.
V .8. Prosedur kerja
1 . Persiapan dan pengambilan bahan/spesimen dari pasien/responden:
• Jel Wharton tali pusat diambil dari tali pusat bayi yang ditolong persalinannya di
RSCM dengan izin orang tua/wali responden sesudah menandatangani informed
consent, termasuk membran amnion plasenta secukupnya.
• lrisan daerah limbus dan kornea kadaver di kamar mayat RSCM ( <24 jam pos
mortem) dengan izin keluarga/wali responden sesudah menandatangani informed
consent.
2. Langkah Kerja di Ruang Bersalln RSCM
I. Wali bayi yang baru lahir diminta kesediaannya untuk berpartisipasi dalam penelitian
yang dilakukan, dengan cara bersedia memberikan izin untuk pengambilan tali pusat
yang umumnya dibuang bersama plasenta dari bayi dibawah perwaliannya.
2. Wali diminta mengisi dan menandatangani informed concent sesudah isi naskah
penjelasan dibacakan oleh dokter yang akan menolong persalinan dan dimengerti
oleh orang tualwali subjek .
. Cara pengambilan spesimen tali pusat:
1. Tali pusat (TP) bagian distal dipotong (10-15 cm) dan dicuci dengan NaCl 0,9% steril
sampai darah yang tersisa dalam arteri dan vena umbilikal seminimal mungkin.
2. Tali pusat direndam dalam larutan povidon iodine 0,5% selama 5-10 menit, lalu bilas
kembali dengan NaCl 0,9% sampai bersih.
3. Tali pusat yang sudah dibilas dipotong memanjang dengan gunting steril, sehingga
bagian dalam tali pusat terekspos PBS dan dimasukkan dalam tabung/botol steril
berisi larutan PBS+penstrep 1% (yang sudah dipersiapkan sebelumnya), hingga
semua baglan TP terendam.
4. Disimpan dalam freezer 4°C sampai dikirim ke laboratorium Balitbangkes (dalam 24
jam postpartum) pada hari dan jam kerja (08.00-16.00 wib).
11
3. Langkah Kerja di Kamar Operasi RSCM
I. Subjek yang akan diminta persetujuan tindakan, diberikan penjelasan terkait
rencana pengambilan sebagian jaringan limbusnya saat operasi avulsi pterygium
dengan transplantasi limbus autograf.
2. Subjek dipersilakan menandatangani informed consent.
Cara pengambilan spesimen limbus:
1. Pada prosedur operasi avulsi pterygium yang disertai transplantasi limbus autograf,
saat persiapan autograf diperhitungkan tambahan panjangnya graft limbus sekitar 1-
2mm untuk keperluan penelitian ini.
2. Limbus sepanjang 1-2mm ini segera dimasukkan dalam tabung cryovial steril
berisi PBS + penstrep 1 % yang telah disediakan.
3. Disimpan dalam freezer 4°C sampai dikirim ke laboratorium Balitbangkes (dalam 24
jam pasca operasi) pada hari dan jam kerja (08.00-16.00 wib).
Persiapan Bahan di Laboratorium
Semua bahan yang akan digunakan disiapkan, preparasi medium standar, berbagai
senyawa kimia disiapkan di SSC kelas II dalam keadaan steril dengan memperhatikan
kaidah Good Laboratory Practice (GLP).
4. Urutan Pemeriksaan Laboratorium
Penelitian yang akan dilakukan merupakan penelitian eksperimental multiyears
berbasis laboratorium dengan tahapan sebagai berikut:
a. Preparasi dan isolasi SPM dari jel Wharton tali pusat yang telah diuraikan
penelitian sebelumnya.
b. Kultur SPM dari tali pusat dengan medium standar, complete culture medium
(CCM).
c. Modifikasi prosedur isolasi SPM yang telah diuraikan penelitian sebelumnya.
d. Karakterisasi dan identifikasi SPM manusia dengan flow cytometry memakai
petanda CD90, CD105, CD166, CD34 dan CD45.
e. Membuat prosedur kultur eksperimental untuk induksi diferensiasi SPM menjadi
SPL secara in-vitro yang merupakan modifikasi antara metode Gu dkk {2009)
dan Ahmad dkk (2007).
12
f. ldentifikasi petanda SPL (p63+/K12"/Nodar/ABCG2+) hasil induksi SPM manusia.
V.9. Protokol Pemeriksaan Laboratorium
Prosedur isolasi mononuclear cells dari jel Wharton tali pusat (Wang dkk, 2004)
1. Tali pusat segar direndam dalam HBSS selama 1-24 jam sebelum jet Wharton
diproses. Dilakukan pemisahan sel mesenkim jet Wharton yang meliputi jaringan
penunjang: subamnion, perivaskular, dan intervaskular dari vaskular tali pusat,
dilakukan pengerokan jaringan mesenkim dengan skalpel dan ditempatkan pada
tabung Falcon, disentrifugasi 250g selama 5 menit pada suhu ruang. Pellet dicuci
dengan serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
UmbilicaJ Cord Compartments Contaimng MSCs
Gambar 5. Penampang lintang tali pusat dan bagiannya (Troyer dan Weiss, 2008)
2. Sel disentrifugasi kembali 250g selama 5 menit pada suhu ruang, lalu ditambahkan
kolagenase (2mg/ml) selama 16 jam pada 37°C, dicuci dan diberi tripsin 2,5%
selama 30 menit pada suhu 37°C dengan agitasi. Selanjutnya sel dicuci dan dikultur
dengan DMEM dan ditambahkan 10% fetal bovine serum (FBS) serta glukosa (4.5
g/I) dan disimpan dalam inkubator 37°C pada C02 5%.
3. Sel diinapkan semalam agar menempel pada alas botol kultur dan sel yang tidak
menempel dibilas dengan PBS, bersamaan dengan penggantian medium keesokan
harinya.
4. Penggantian medium selanjutnya dilakukan dua kali seminggu.
5. Ekspansi medium memakai lscove modified Dulbecco medium (/MOM; Gibco,
Grand Island, NY) dan 20% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT) dengan
supplemen 10 ng/ml bFGF, 100 U penicillin, 1000 U streptomycin, dan 2 mM L
glutamine (Gibco ).
13
6. Derivat single cell SPM didapatkan dari set yang menempel pada pasase kedua
dengan cara dilusi serial, hingga densitas set mencapai 30 sel/96-we// plate dalam
medium ekspansi.
7. Koloni yang tumbuh selanjutnya dikuftur lebih lanjut dan diidentifikasi SPMnya.
8. Jika sel aderen sudah mencapai konfluensi 50%-60% dilakukan tripsinasi dan dibifas
dua kali dengan phosphate-buffered saline (PBS; Gibco) dan disentrifugasi 1000rpm
selama 5 menit dan ditanam kembali 1 :3 dengan kondisi kultur yang sama.
Penghitungan sel dengan Hemacytometer dan Penilalan Viabilitas dengan Trypan
Blue (Bongso dkk, 2004)
1 . Campur 10 µI suspensi sel dengan 10 µI trypan blue 0.4%. Biarkan larutan selama 3-
5 menit, suhu kamar.
2. Suntikkan 1 O µI trypan bfuelcampuran sel di bawah penutup hemacytometer. Volume
ini untuk menjamin hemacytometer tidak terisi lebih. Letakkan hemacytometer
dibawah mikroskop binocular dan atur fokusnya.
3. Hitung set yang tidak berwama (viable) dan yang berwama biru (non-v iable) pada
bujur sangkar lebar di tengah hemacytometer dengan perbesaran lensa 1 OX. Jika sel
total <50, hitung bujur sangkar tambahan sampai jumlah set 50-100.
4. Hitung jumlah total set yang viable dengan rumus berikut:
Total sel hidup = sel hidup/jumlah kotak x 2 x 1 0000 x volume total (dalam ml)
5. Hitung persentase sel hidup dengan rumus berikut:
Jumlah sel hidup
o/o sel hidup = -----·--··········-····-··-·· x 100%
Jumlah sel total
6. Silas hemacytometer Neubauer dan tutup slide dengan alkohol 70%, lalu keringkan.
Kriopreservasi Mononucleated cells (Bongso dkk, 2004)
Konsentrasi final dimethylsulfoxide (DMSO) 5% dan 1 1 .25% protein (albumin serum
human) dalam cRPMI.
1 . Larutkan kembali MC (dari isolation Fresh MC) pada 1 x 107 limfosit hidup/ml, 12.5%
HSA dalam medium RPMI 4°C, di dalam tabung falcon 50 ml.
2. Tambahkan 2X medium pembeku 4°C secukupnya untuk melipatgandakan volume
suspensi sel.
3. Tabung segera diletakkan di atas es.Hindari mencampur atau mengagitasi sel.
Perlahan ambit suspensi set dengan pipet dan bagikan 1 ml per cryovial di atas es.
4. Tempatkan cryovial dalam pre-cooled Mr. Frosty-style freezing container yang sudah
diisi isopropanol 70% sesuai instruksi pabrik. Simpan datam freezing container pada
-80°C.
Thawing Mononuclear cells (Bongso dkk, 2004)
Bila mononucleated cells tidak di-thaw dengan benar, maka viabilitas dan pemulihan sel
dapat terganggu. Sel mungkin tidak menunjukkan hasil yang baik pada assay fungsional.
Secara umum, sel dapat cepat di-thaw, tetapi didilusi pertahan untuk membersihkan
DMSO. Set dengan interkalasi DMSO pada membrannya sangat rapuh dan harus
ditangani secara hati-hati.
1 . Hangatkan cRPMt sampai 22°-37°C pada water bath 37°C sebelum mulai prosedur
thawing.
2. Pindahkan cryovial dari nitrogen cair ke water bath 37°C. Jika nitrogen cair
merember ke dalam cryovial, longgark.an penutupnya, sehingga nitrogen akan keluar
pada saat thawing.
3. Pegang cryoviel di permukaan water bath sambil menyentil ringan saat thawing
dalam pengawasan penuh. Thawing (1-2 menit) dan proses yang cepat perfu untuk
mempertahankan viabilitas set. Ketika es pada cryovial hampir habis, segera
pindahkan cryovial ke SSC, keringkan dan usap dengan disinfektan sebelum dibuka
penutupnya, untuk mencegah kontaminasi.
4. Tambahkan cRPMI hangat padasuspensi sel datam cryovial per1ahan selama 30
detik. Volume akhir 2 kali volume suspensi sel dan tidak metebihi kapasitas cryovial.
5. Pindahkan suspensi sel yang sudah diencerkan ditambah Sml cRPMt hangat untuk
setiap isi vial (sekitar 4 vial+ 32ml cRPMI hangat) ke dalam tabung falcon 50 ml.
6. Putar sel pada 1200 rpm, selama 7 menit. Buang supematan dan sentil ringan
tabung agar pellet terlepas. Larutk.an kembali dengan cRPMI hangat sesuai volume
yang diinginkan.
7. Lakukan penghitungan jumtah sel hidup dengan hematositometer.
8. Jika dipertukan konsentrat sel, sentrifus pada 1200 rpm selama 7 menit. Buang
supematan dan sentil ringan tabung agar pellet terlepas.
9. Encerkan suspensi set dengan konsentrasi final of 5x106 MC/ml cRPMI media pada
suhu kamar.
15
10. Periksa gumpalan dan ambil dengan pipet atau tip.
1 1 . Untuk assay cytokine (flow-cytometri dengan Facs-calibur), plate 200 ml/well dalam
round-bottom 96-well plate dengan 1x106 sel per well .
12. lnkubasi plate yang sudah ditutup pada suhu 37°C selama 12-18 jam untuk
istirahatkan sel.
Prosedur kultur SPM (Ahmad dkk, 2007)
1. Persiapkan Complete Culture Medium (CCM) yang merupakan campuran dari:
SOOmL DMEM, 100 ml Fetal Bovine Serum (FBS) dengan konsentrasi -16,5%, 6ml
l..glutamine konsentrasi 2mM, 6ml penicillin G konsentrasi 100 units/ml dan
streptomycin sulphate konsentrasi 1 OOµg/ml. Medium difilter melalui unit filter steril
0,22 µm. Dibagi alikuot dan disimpan pada 4°C sampai 2 minggu. Medium harus
dihangatkan sampai 37°C setiap kali akan digunakan.
2. Sel PBMC tersimpan dilarutkan kembali dalam medium kuttur SPM sesudah prosedur
thawing. Setengah medium digantt tiap dua hari sekali.
3. Sel dipanen memakai trypsin 0, 1 % dan EDTA 0,05% dalam 1x PBS dan
dilakukan scraping perlahan memakai rubber policeman.
4. Untuk studi morfologi sel aderen langsung difiksasi pada slide memakai
paraformaldehida 4 %.
5. Amati kuttur hari ke-2-14, ganti medium pada hari ke-2, 5, 8, 1 1 , 14 dan pindahkan
sebagian sel ke petri lain, jika m4lai padat (konfluensi 70%).
Prosedur karakterisasi SPM (Bongso dkk, 2004)
Flow·cytometer diaktifkan dan QC sesuai petunjuk manufacturer dan mencakup analisis
fluorescent beads untuk validasi fungsi laser, flow systems, dan sistem deteksi. Jika
terjadi masalah pada tahap ini harus diperbaiki sebelum pemeriksaan sampel dilakukan.
1. lkuti rekomendasi pabrik tentang antibodi, volume reagen yang sesuai disediakan 6
seri tabung microfuge 1 ,5-ml (panel) seperti berikut:
a) Tabung 1 : CD34 PE
b) Tabung 2: CD105 PE
c) Tabung 3: HLA-Class I: ABC FITC
d) Tabung 4: HLA-Class II : DR, DP
e) Tabung 5: lsotype control
f) Tabung 6: kontrol autofluoresen
16
Tabung berisi cocktails antibodi dapat dibuat sebelumnya dan disimpan dalam gelap
pada 4°C, sampai dibutuhkan.
3. Set dipanen dan dihitung serta dinilai viabilitasnya dengan trypan blue. Sel ditambah
PBS dengan konsentrasi final 1 x 106 set hidup/ml. Diper1ukan 4 x 1 06 untuk
melengkapi protokol.
4. Aliquot antara 25 x 104 dan 5 x 105 set per tabung. Sebagai tambahan siapkan tabung
ke-8 yang diisi suspensi sel sebagai kontrol untuk autofluoresen. Vortex untuk
mencampur dan inkubasi dalam gelap selama 20 menit pada suhu kamar.
5. Cuci set dengan menambahkan PBS 1,5 ml dan tandai setiap tabung. Putar pada
100 g selama 1 menit pada suhu kamar. Buang supernatan, pellet ditambah 1 ml
PBS dan putar ulang kembati sampai 3 kali pencucian.
6. Pellet ditarutkan kembali dalam 500 µL PBS dan divortex sampai tidak terdapat
agregat.
7. Tempatkan suspensi set pada tabung kultur 12 x 75 mm (alat yang
direkomendasikan) dan dianalisis dengan flow cytometer. Analisis tabung 6 ter1ebih
dahulu, dilanjutkan tabung 5 (kontrot isotipe). Hasil pada kedua tabung ini
digunakan untuk mengatur gates and analysis regions untuk menilai hasil
pemeriksaan 4 tabung lainnya.
Analisa terhadap ekpresi antigen permukaan memakai FACS Calibur, USA)
memakai software Cell Quest. Minimal 10.000 sel dianalisa persempel.
Tripsinasi MSC di resuspensi memakai DMEM 1 0% FBS dan di cuci dengan
PBS 3%FBS. Suspensi MSC diinkubasi dengan antibodi monoklonal dengan
konjugat APC untuk marker CD 90 dan PE untuk CD 34.
Labeling SPM dengan BrdU (Ahmad dkk, 2007)
Kuttur dengan konfluensi 70% ditambah media yang mengandung 1 O µmoVI 5-bromo-20-
deoxyuridine (BrdU) selama 24 jam untuk mendapatkan sel yang mengekspresikan
BrdU.
1. Pada akhir masa inkubasi sel diwarnai dengan antibodi terhadap BrdU untuk
membuktikan bahwa labeling berhasil.
2. Kultur sel pada ruang slide difiksasi dengan ice-cold acetone/methanol ( 1 : 1) pada
suhu 20°c selama 30 menit.
17
3. Sesudah diinkubasi dengan HCI 2N pada suhu 20°C selama 30 menit dan dibilas
dengan PBS tiga kali, slide diinkubasi semalam dengan antibodi terhadap BrdU yang
diencerkan 1 :500 pada suhu 4°C.
4. Sampel kontrol negatif diinkubasi dalam PBS tanpa antibodi primer.
5. lnkubasi dengan antibodi sekunder dilakukan pada suhu 37°C selama 45 menit dan
ditambahkan anti-fading mounting medium lalu diperiksa memakai mikroskop
ftuoresens.
Protokol diferensiasi SPM menjadi SPL in-vitro sesuai protokol Ahmad dkk, 2007
Preparasl Media lnduksi
1. Medium fibroblas dengan fetal calf serum (FCS} 10%, yang terdiri dari DMEM
glukosa rendah tanpa piruvat, asam amino non-esensial 1 %, penicillin-streptomycin
1%, dan L-glutamine 1%.
2. Medium epitel terdiri dari DMEM glukosa rendah dengan piruvat tiga bagian, satu
bagian medium Ham's F12, FCS 10%, penicillin-streptomycin 1 % , hidrokortison,
insulin, tri-iodothyronine, adenin, toxin kolera dan epiderma (EGF).
3. Semua media difilter secara steril dengan filter 0.22µm, disimpan pada 4°C.
Coating of Tissue Culture Plates dengan Komponen Matrlks Ekstraselular
1 . Lyophilized collagen IV dari plasenta manusia ditambahkan asam asetat 0,25%
sampai konsentrasi 0,5 mg/ml dan disimpan pada 4°C selama 3 jam dengan
pengadukan berkala.
2. Ceruk kultur jaringan 2cm2 dilapisi dengan kolagen IV dengan cara menuangkan
larutan kolagen IV 200µ1 dan diamkan semalam pada 4°C.
3. Keesokan harinya larutan kolagen IV dibilas dengan phosphate-buffered saline (PBS)
sebelum penanaman kultur sel.
Kultur Epitel Limbal Manusia memakai Komponen Matriks Ekstraselular
1 . Lapisan paling dalam limbal kadaver dipisahkan, lapisan epitel limbal dipotong
potong seukuran 1mm2 dan diinkubasi dengan larutan tripsin 0,05% setama 20
menit dalam inkubator jaringan.
2. Suspensi sel yang dihasilkan dipisahkan dari potongan limbal dan ditambahkan
medium epitel, disentrifugasi 1000rpm selama 3 menit dan supernatan dibuang.
3. Pellet sel ditambah medium epitel lagi.
4. Ketiga langkah diatas diulang sampai tiga kali memakai jaringan limbal yang
sama dan hasil suspensi pellet sel 3 kali proses tripsinasi digabung.
5. Tiap 2mm2 ceruk kultur jaringan diisi 30.000 sel epitel limbal yang hidup.
6. Kokultur epitel limbal dan 3T3 fibroblas mencit (diinaktivasi pada keadaan mitosis
dengan cara diinkubasi 2 jam dalam mitomycin C 1 O µg/ml) dengan kepadatan
24.000 sel/cm2 digunakan sebagai standar baku kultur.
7. Semua sediaan kultur disimpan dalam inkubator 37°C pada C02 5%.
Penggantian medium dilakukan pada hari ke-3 dan selanjutnya rutin 2 hari sekali.
lsolasi dan Kultur Fibroblas Limbal Manusia
1 . Jaringan limbal kadaver dipotong-potong seukuran 1 mm2. Larutan kolagenase IV
dalam medium fibroblas tanpa FCS sejumlah 3-mg/ml ditambahkan pada
potongan jaringan limbal.
2. Campuran ini diinkubasi 1 jam dalam inkubator kultur jaringan, lalu larutan
kolagenase IV dibuang.
3. Tambahkan kembali larutan kolagenase IV dalam medium fibroblas tanpa FCS
sejumlah 3-mg/ml pada potongan jaringan limbal dan diinkubasi 8 jam dalam
inkubator kultur jaringan.
4. Larutan pada langkah ke-3 disentrifugasi pada 1000rpm selama 3 menit sesudah
jaringan limbal disisihkan.
5. Supernatan dibuang dan pellet set ditambah medium fibroblas yang mengandung
FCS 10%.
6. Suspensi sel ditempatkan pada ceruk kultur jaringan 2cm2 dan diinapkan dalam
inkubator kultur jaringan semalam.
7. Keesokan harinya kultur fibroblas limbal ditambah medium fibroblas selanjutnya
diganti tiap 2-3 hari sekali. Fibroblast limbal diekspansi melalui subkultur sampai
10-15 pasase.
Conditioning Medium Epitel memakai Fibroblas Limbal
1 . Fibroblas limbal diinaktivasi mltosisnya dengan menambah 1 O µg/ml mitomycin C
pada medium kultur dan diinkubasi selama 2 jam pada 37°C.
2. Fibroblas selanjutnya dicuci 3 kali dengan PBS dan ditempatkan kembali dalam
flask kultur dengan kepadatan 56.000 set hidup/cm2 dan diinapkan dalam
inkubator kultur jaringan semalam.
1 9
3. Keesokan harinya, medium fibroblast dibuang, flask lalu diirigasi dengan PBS,
tambahkan 400 µl/cm2 medium epitel dan disimpan dalam inkubator kultur
jaringan.
4. Medium epitel yang sudah dikondisikan dengan fibroblas limbal dikumpulkan
setiap hari dan selalu diganti medium epitel segar 400 µl/cm2 selama 7 hari, dan
disimpan pada -20°C.
5. sesudah dikumpulkan selama 7 hari semua medium epitel tersimpan
disentrifugasi pada 1 OOOrpm selama 3 men it dan difilter secara steril dengan filter
0,22-µm. Jika disimpan pada 4°C dapat digunakan dalam 1 bulan, sedangkan
bila disimpan pada -20°c dapat digunakan maksimum 3 bulan.
lmmunocytochemistry untuk Kultur Sel
1 . Medium pada ceruk kultur jaringan dibuang dan diirigasi dengan PBS secara
berhati-hati dan diinkubasi dengan formaldehida 3,7% dalam PBS selama 30
menit pada suhu kamar.
2. PBS tiga kali 5 menit pada suhu kamar, Triton X-100 0,5%, serum domba 2%
dalam PBS selama 1 jam pada suhu kamar, dan diluted primary antibody dalam
PBS diinapkan semalam pada 4°C.
3. Keesokan harinya, antibodi primer dibuang dari ceruk kultur lalu dibilas dengan
PBS tiga kali selama 5 menit pada suhu kamar. Ceruk diinkubasi dengan 1 O
µg/ml FITC-conjugated sheep anti-mouse /gs yang diencerkan dalam PBS
selama 30 menit pada suhu kamar dan keadaan gelap.
4. sesudah antibodi sekunder dibersihkan, ceruk diinkubasi 3 kali dengan PBS
selama 5 menit dalam gelap.
5. Sel dalam ceruk diinkubasi dengan larutan Hoechst 33342 10 µg/ml dalam air
steril selama 1 O menit dalam k:eadaan gelap pada suhu kamar.
6. sesudah larutan Hoechst 33342 dibuang, tiap ceruk diinkubasi tiga kali dengan
PBS dalam gelap, dan biarkan terisi PBS. Ceruk segera diamati dengan
mikroskop inverted dan didokumentasikan.
7. Untuk double staining, sel difiksasi, dipermeabilisasi, dan diblok, sebelum
diinkubasi dengan antibodi pertama (p63, CK12 64k0, Nodal, atau ABCG2)
selama 1 jam. Sel-selnya lalu dicuci dengan FCS 5% dan PBS. lalu diinkubasi
dengan antibodi kedua (CK3/12, atau CK10) selama 1 jam.
8. Sel-sel ini dicuci kembali dengan FCS 5% dan PBS sebelum penambahan
antibodi sekunder (tetramethylrhodamine isothiocyanate-conjugated anti-mouse
lgG1, dilusi 1:100; FITC-conjugated anti-mouse lgG2, dilusi 1:100;
Rhodamine/FITC-conjugated anti-rabbit lgG, dilusi 1 : 100; atau Rhodamine
conjugated anti-goat lgG dilusi 1 : 100 selama 30 menit); selanjutnya sel-sel dicuci
sebelum fluorescence microscopy.
V.10 DEFINISI OPERASIONAL
Subjek penelitian yaitu bayi baru lahir di RS Cipto Mangunkusumo yang orang
tua/walinya bersedia dan mengizinkan spesimen dari tali pusat dan plasenta bayi
dimanfaatkan untuk penelitian; serta kadaver yang meninggal <24 jam sebelum
pengambilan jaringan dari limbus dan komea, dengan persetujuan keluarga.
V.11. PERTIMBANGAN ETIK
Persetujuan etik untuk subjek penelitian manusia diberikan oleh Komisi Etik Sadan
LHbangkes (terlampir).
21
VI. HASIL PENELITIAN
Preparasi tali pusat (TP) di ruang bersalin harus terjaga sterilitasnya. Tali pusat bagian distal dipotong 7-10 cm dan dibilas dengan NaCl 0,9% sampai darah yang tersisa seminimal mungkin. Selanjutnya TP dibelah memanjang dengan gunting steril dan direndam dalam larutan povidon-iodin e 0,5% selama 5-10 menit untuk mencegah kontaminasi. Tali pusat dibilas kembali dengan NaCl steril sebelum dimasukkan tabung steril untuk dikirim ke laboratorium ser punca di Labnas lantai 3 Balitbangkes. Semua bagian TP harus terendam PBS dan segera dibawa ke laboratorium dalam 24 jam pasca persalinan (Yudha UGM, 2012).
'
Gambar 6. Preparas� tali pusat sebelum kultur.
Penelitian eksperimental telah dilaksanakan dengan beberapa modifikasi dengan hasil sebagai berikut:
I. Modifikasi prosedur isolasi SPM dari jel Wharton tali pusat manusia:
Cara isolasi SPM dari jel Wharton (eksplantasi) dan modifikasi medium kultur
(modiflkasi protokol dari UGM, 2012)
t Tali pusat dipotong-potong menjadi 1 mm2 dan dibersihkan dari darah dengan medium DMEM low glucose (LG):HAM F-12 (1 : 1 ) ditambah 1 0% FBS atau high
22
glucose ditambah FBS 20%, lalu ditempatkan pada cawan petri dengan medium
sebanyak 1-2cc, sehingga jaringan tali pusat dapat menempel pada petri dish dan
diinkubasi pada suhu 37°C dan 5% C02 diamati keesokan harinya.
Amati jaringan eksplan sedikitnya setetah 24 jam, apabila sudah ter1ihat adanya sel
sel tumbuh dan metekat pada cawan petri, maka medium ditambah sampai jaringan
eksplan ini terendam dalam medium.
3. Medium diganti dengan medium baru pada hari ke-4 dilanjutkan 3 hari sekali, tetap
diamati setiap hari. Apabila set yang sudah tumbuh di sekitar jaringan eksplan cukup
banyak, maka jaringan dapat diambil dan dikultur di cawan petri yang baru dengan
metode yang sama. Sel yang menempel dipertahankan sampai berkembang hampir
penuh atau konfluensinya 80-90%.
4. Pemindahan sel ke media yang baru dilakukan dengan cara menambahkan trypsin
0,050/o dan untuk menghentikan aktivitas enzim ditambahkan 0,02% EDTA, dilakukan
satu kali dalam seminggu selama dua bulan dan apabila perbanyakan sel
mencukupi, sel disimpan dengan cara vitrifikasi dalam larutan nitrogen cair pada
suhu -1 96°C dalam larutan pembeku sel (80% DMEM, 10% DMSO dan 10% FBS).
5. Pengamatan dan pencatatan hasil observasi dilakukan sampai diferensiasi spontan.
Gambar 7. Set punca mesenkim hari ke-6 (a) dan ke-8 (b), medium DMEM /ow glucose,
HAM F-12, FBS 10%.
Gambar 7dan 8 menunjukkan pertumbuhan SPM yang baik dan tidak terkontaminasi,
sayang pada beberapa well, seperti tampak pada Gambar 9, kultur sel terkontaminasi
pada hari ke-1 1 , sebelum sel dipasase. Kontaminasi ini dapat terjadi karena sterilitas
saat melakukan intervensi kultur set kurang terjaga atau lingkungan laboratoriium yang
kurang steril, terjadi kondensasi di ruangan laboratorium.
Gambar 8. Sel punca mesenkim hari ke-11 (a, b, c) dan hari ke 13 (d), medium DMEM low
glucose, HAM F-12, FBS 10%.
Gambar 9. Sel punca mesenkim hari ke-11 yang terkontamlnasl, medium DMEM /ow
glucose, HAM F-12, FBS 10%.
Gambar 10. Sel punca mesenklm hari ke-13 (a), dan hari ke 14 (b), medium DMEM high
glucose, FBS 20%.
24
Gambar 11. Set punca mesenkim hari ke-16 (a), dan hari ke 20 (b), medium DMEM high
glucose, FBS 20%.
Gambar 12. Sel punca mesenkim hari ke-27(a), dan hari ke 30 (b), medium DMEM high
glucose, FBS 20%.
Gambar 10, 1 1 , dan 12 rnemperlihatkan kultur SPM dengan medium yang berbeda, yaitu
DMEM high glucose (HG) ditambah FBS 10%, tanpa HAM F-12. Pertumbuhan SPM
terkesan kurang maksimum. tidak terjadi konfluensi seperti yang diharapkan, bahkan
sampai waktu 30 hari kultur. Keadaan ini menunjukkan bahwa jenis medium DMEM
LG+HAM F-12 merupakan medium yang lebih tepat untuk kultur SPM yang diisolasi dari
jel Wharton manusia, dibandingkan DMEM HG yang memberikan hasil pertumbuhan
SPM lebih baik pada kultur SPM yang diisolasi dari sum-sum tulang mencit.
Konfluensi set 80-90% rata-rata terjadi pada hari ke-1 3 sampai hari ke-15 pasca isolasi
dengan kedua metoda. Jumlah sel per ceruk untuk metode eksplan yaitu bervariasi
6,7x1 04 sampai 6,4x1 05/ml. sedangkan pada metode enzimatik bervariasi antara
2,2x104 sampai 5,9x105, terkesan lebih sedikit dibanding metode eksplan saat pasase
pertama.
25
Gambar 13. Sel punca mesenkim hari ke-34(a), dan hari ke 37 (b), degenerasi sel total hari
ke-40 (c), medium DMEM high glucose, FBS 20%.
Pada Gambar 1 3 terfihat SPM berdiferensiasi spontan menyerupai sel saraf dengan
beberapa dendrit pada hari ke-34 dan berdegenerasi spontan mulai hari ke-37. Pads
hari ke-40 kultur sel menunjukkan degenerasi total dan tampak debris yang bercampur
dengan gambaran yang menyerupai kontaminasi.
Medium kultur sangat menentukan berhasil tidaknya pertumbuhan sel seperti yang
diharapkan. Pelaksanaan semua kegiatan laboratorium, mulai preparasi spesimen dan
medium sampai penggantian medium secara berkala merupakan satu rangkaian
kegiatan yang harus dilakukan dengan cermat, steril, dan penuh keteliUan agar
mendapatkan hasil yang memuaskan.
Metode enzimatis isolasi SPM dari jel Wharton (modifikasi UGM, 2012)
1 . Jaringan tali pusat diambil dari klinik bersalin dengan informed consent yang jelas.
2. Jaringan tali pusat yang diperoteh dimasukkan datam PBS yang mengandung 1%
penstrep dan dibawa ke laboratorium.
3. Tali pusat dicuci dengan larutan iodin 10 menit untuk menghilangkan kemungkinan
adanya kontaminan dan dicuci dengan PBS steril dengan 1 OOOU/ml penicillin dan
1000 µg/ml streptomisin untuk mencuci darah yang ikut terambil.
26
Tali pusat dipotong-potong menjadi 1 mm2 dan didigesti dengan 0,05% trypsin-EDTA
pada 37°C dan digoyang berkala selama 60 menit.
Aktivitas trypsin dinetralisir dengan menambahkan medium DMEM yang ditambah
10% cairan amnion. dan difilter untuk menghilangkan debris dan disentrifus pada
1500 rpm selama 1 O men it.
Pellet yang terbentuk diambil dan dicuci dua kali dengan DMEM + 10% cairan
amnion, 1 mM glutamine, 25 mM NaHC03, 1% larutan penicillin-streptomycin-
antimycotic dan disentrifus 1500 rpm selama 1 O menit.
7. Supernatan dipisahkan dan pellet ditambah medium dan dikultur kedalam cawan
petri sesudah dihitung jumlah selnya dan dimasukkan kedalam inkubator pada suhu
37°C dan 5% C02.
8. Medium diganti pada hari ke-2 dan diamati setiap hari. Sel yang tidak melekat
dipindahkan ke cawan petri baru, sedangkan sel yang menempel dipertahankan
dengan medium sampai sel berkembang penuh atau konfluensinya 90%.
Gambar 9. Sel punca mesenkim hari ke-2 well 1 (a) dan 2 (b), medium DMEM low
glucose, HAM F-12, FBS 10%.
Gambar 10. Sel punca mesenkim hari ke-10 well 1 (a) dan 2 (b), medium OMEM /ow
glucose, HAM F-12, FBS 10%, perbesaran 40x.
27
Metode isolasi SPM enzimatik memberikan hasil sel yang sama baik dengan metode
eksplan. Metode ini baru dilakukan akhir Desember 2012 lalu, sehingga belum dapat
diamati lebih lanjut pertumbuhan dan perkembangan kultur lebih dari 1 O hari.
Komposisi medium kultur yang digunakan yaitu 1). DMEM low-glucose+HAM F-12
( 1 : 1 , Gibco®) dibandingkan 2). DMEM high-glucose+HAM F-12 {1 :1 , Gibco®) keduanya
dttambah FBS 10% (Gu, 2009; Soleimani, 2009). Perbedaan komposisi DMEM medium
1 dan 2 hanya pada kadar glukosa, yaitu 5,56:25 mM. Uji t sampel bebas digunakan
untuk membandingkan rerata jumlah sel pada medium 1 dan 2 pada pasase kedua,
batas kemaknaan p=0,05, SPSS 15.0.
Pertumbuhan set pada medium kultur 1 lebih optimal dibanding medium 2, berdasarkan
jumlah set pada pasase kedua, sesudah tiap ceruk diisi 1x104 sel/ml. Jumlah sel pada
pasase-2, 4 hari sesudah pasase-1 terlihat dalam Tabel 1 .
lsolasi SPM dari jel Wharton tali pusat manusia umumnya dilakukan dengan dua
metoda, yaitu metoda eksplan dan enzimatik. Penelitian ini membuktikan bahwa metoda
eksplan jauh lebih mudah dilakukan dengan hasil yang baik, dibandingkan metode
enzimatik. label 2 menunjukkan perbedaan nyata antara kedua metoda isolasi yang
kami gunakan.
Tabel 2. Perbedaan tahapan isolasi metoda eksplan dan enzimatlk
Metoda eksplan
1 . Cacahan TP langsung dipindahkan dalam
4-multi-well plate, 1-2 cacahan per ceruk
2. Tambahkan medium kultur 250-300µ1 per
ceruk
3. lnkubasi 18-24 jam pada 37°C, C02 5%,
diobservasi lalu tambahkan medium sampai
cacahan terendam medium.
Metoda enzimatik
1 . Cacahan �cm TP ditambah trypsin 0,25%
sampai semua cacahan terendam selama 1-
2 jam
2. Saring dengan kasa steril rangkap 4,
masukkan tabung steril
3. Sentrifugasi 200 G selama 1 O menit,
supernatan dibuang
4. Tambahkan medium kultur 5ml kedalam
pellet
5. Sentrifugasi kembali 200 G selama 1 O
menit, supematan dibuang
6. Tambahkan medium kultur 5ml kedalam
pellet � suspensi sel
7. Pindahkan suspensi sel 500µ1 per ceruk
Rerata jumlah set pada medium 1 lebih tinggi dibanding medium 2 dengan perbandingan
3,3:1,9 (x104), tetapi secara statistik tidak berbeda bermakna, p=O, 164 (independent
samples t-tesf). Jumlah sel awal per ceruk yaitu 1x104 sel/ml dan menjelang pasase
kedua hasil kultur menunjukkan bahwa rerata jumlah sel yang tumbuh pada medium
kultur DMEM LG cenderung lebih tinggi dibanding medium DMEM HG, meskipun
perbedaan ini tidak bermakna secara statistik.
29
VIII. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
• Eksperimen inl berhasil mengembangkan dan memodifikasi prosedur isolasi SPM'
dari jel Wharton tali pusat manusia menggl!nakan metode eksplan dan enzimatik
dengan hasil sama balk dengan prosedur UGM, 2012.
• lnduksi SPM dari jel Wharton kearah SPL belum terlaksana karena beberapa·.
hambatan, seperti masalah penggantian sumber limbus dari kadaver menjadi
pasien yang dioperasi avulsi (pengupasan) pterygium dengan transplantasi
limbus autograf dan kontaminasi kultur set berulang.
• Jika nanti berhasil didapatkan conditioned medium limbal manusia dan hasil
induksi SPM menunjukkan hasil yang menyerupai SPL original dari manusia,
maka eksperimen per1u dilanjutkan dengan penelitian in-vivo dan preklinik agar
temuan ini dapat diaplikasikan kepada manusia pada suatu saat nanti sebagai
altematif terapi sel untuk mengatasi kebutaan akibat kekeruhan kornea dan
defisiensi sel punca limbal.
.jpeg)
.jpeg)
